Dissertation (Metadaten)
Titel:Die Rolle von TGF-beta bei der Regulation des Biglykan-Gens und bei der Tumorprogression des Pankreaskarzinoms
 
Autor:Stephanie Groth
 
URN:NBN:urn:nbn:de:gbv:8-diss-26004
 
Fakultät:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
DDC Sachgebiet:610 Medizin und Gesundheit
 
Datum der mdl. Prüfung:09.11.2007
 
Referent(in):Prof. Dr. Kalthoff
Korreferent(en) Korreferentin:Prof. Dr. Dr. Bosch
 
Beschreibung:TGF-β1 ist ein Zytokin, das an der Regulation verschiedenster biologischer Prozesse beteiligt ist und u.a. die Bildung der extrazellulären Matrix durch die Induktion des kleinen leucin-reichen Proteoglykans Biglykan (BGN) fördert. Die intrazelluläre Signaltransduktion, die zur Aktivierung des BGN Gens führt, ist sehr komplex und abhängig von der Aktivierung des Smad- (Chen et al., 2002) und des p38-MAPK-Signalweges (Ungefroren et al., 2003), wobei beide über das „stress response“ Gen GADD45β miteinander verknüpft sind (Ungefroren et al., 2005). Unter Einsatz verschiedener kinase-defizienter und kinase-aktiver Mutanten sowie spezifischer pharmakologischer Inhibitoren in der TGF-β responsiven Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 konnte gezeigt werden, dass die Kinaseaktivität und die Smad-aktivierende Funktion des TGF-β Typ I Rezeptors (ALK5) für die Induktion der BGN-Expression erforderlich sind. Durch Experimente, in denen Panc-1-Zellen in Suspension kultiviert oder mit dem Zytoskelett zerstörenden Toxin Cytochalasin D behandelt wurden, konnte gezeigt werden, dass der TGF-β-Effekt auf BGN abhängig von der Zelladhäsion ist. In einer weiteren Versuchsreihe, in denen Panc-1-Zellen mit einem Rac1-Inhibitor behandelt wurden, konnte deutlich gemacht werden, dass der TGF-β-Effekt auf BGN durch die kleine GTPase Rac1, die auch an der Weiterleitung von Adhäsions-Signalen beteiligt ist, vermittelt wird. Außerdem konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Panc-1-Zellen, die unterschiedliche Rac1-Mutanten (dnRac1, WT-Rac1, caRac1) ektop exprimierten, unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen der Zellen (adhärent oder in Suspension) gezeigt werden, dass Rac1 auf der Ebene von p38 wirkt und keinen Einfluss auf die Smad3-Aktivierung und die GADD45β-Induktion hat. Schließlich konnte durch die pharmakologische Inhibition des NAD(P)H-Oxidase-Komplexes mittels Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) gezeigt werden, dass Rac1 seine Funktion bei der p38-Aktivierung als Untereinheit der reaktive Sauerstoffspezies (ROS: „reactive oxygen species“)-produzierenden NAD(P)H-Oxidase ausübt. Dass auch ROS selbst eine wichtige Rolle bei der TGF-β-Regulation von BGN spielen, konnte durch Experimente mit Radikalfängern und Antioxidantien demonstriert werden. Die Vermutung, dass die NAD(P)H-Oxidase als Quelle der ROS-Produktion an diesem Prozess beteiligt ist, wurde weiterhin dadurch unterstützt, dass in den Panc-1-Zellen verschiedene Nox und phox Untereinheiten dieses Enzymkomplexes exprimiert werden. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit die Effekte der TGF-β-Signalwirkung auf das Wachstumsverhalten von Pankreaskarzinomzellen in vitro und auf ihre Tumorigenität in vivo analysiert. Dazu wurden die biochemischen und zellulären Effekte von zwei ALK5-Mutanten nach Überexpression in Panc-1-Zellen untersucht. Diese Mutanten besitzen beide eine intakte Kinase-Domäne, unterscheiden sich aber in ihrer Fähigkeit, Smads zu aktivieren, wobei konstitutiv-aktives RImL45 (caRImL45) aufgrund einer Mutation in der L45-Schleife, im Gegensatz zu konstitutiv-aktivem ALK5 (caALK) keine Smads binden kann. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die stabile Expression von caALK5 (im Gegensatz zu caRImL45) den antiproliferativen Effekt von TGF-β nachahmen konnte, was auf der Fähigkeit dieser Mutante beruht, den Smad-Signalweg zu aktivieren. Im Gegensatz zu den caRImL45-transduzierten Panc-1-Zellen zeigten caALK5-transduzierte Zellen eine epitheliale-mesenchymale Transdifferenzierung (EMT) und eine erhöhte Expression von metastasierungs-assoziierten Genen. Zusätzlich kam es in diesen Zellen zu einem erhöhten Expressionsverhältnis von anti-angiogenen (TSP-1, PAI-1) zu pro-angiogenen Faktoren (VEGF-A). Nach einer orthotopen Transplantation dieser Zellen in immundefiziente Mäuse kam es durch caALK5 im Gegensatz zu caRImL45 zu einer Reduktion des Primärtumorwachstums kam. Allerdings förderte diese Mutante im Gegensatz zu caRImL45 die Bildung von Lebermetastasen, woraus geschlossen werden kann, dass der Smad-Signalweg in Bezug auf den Primärtumor zwar anti-onkogen, in Bezug auf die Metastasenbildung aber pro-onkogen wirkt.
 
Schlagworte:TGF-beta, Biglykan, Proteoglykan, Zelladhäsion, Tumorprogression, ALK5, Pankreaskarzinom
 
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