Identifikation und Charakterisierung von Genen der Tocopherol-Biosynthese aus Raps (Brassica napus L.)
Raps ist weltweit eine der bedeutendsten Ölpflanzen und
stellt eine wichtige Quelle für Vitamin E dar. Als Vitamin E wird die
antioxidativ wirkende Gruppe der Tocochromanole bezeichnet, welche aus acht
Substanzen besteht. Man unterscheidet die zwei Untergruppen Tocopherol und
Tocotrienol, die jeweils in α-, β-, γ-,
und δ-Form vorkommen. Rapsöl enthält
bis zu 1000 ppm Tocopherol, wobei γ-Tocopherol
gefolgt von α-und δ-Tocopherol den größten Anteil ausmacht. Für
die menschliche Ernährung hat α-Tocopherol
die größte Bedeutung, während für die Ölstabilität γ- und δ-Tocopherol
wirksamer sind. Für die Rapszüchtung ergeben sich hieraus als Ziele die
Entwicklung von Rapssorten mit gesteigertem Tocopherolgehalt und mit speziellen
Tocopherol-Zusammensetzungen. Bis heute konnte die Analyse des
Tocopherolgehaltes mit nicht invasiven Methoden, wie der
Nahinfrarot-Spektroskopie (NIRS) nicht zuverlässig realisiert werden. Darüber
hinaus lässt diese Methode keine Unterscheidung der einzelnen Tocopherole zu.
Die Tocopherol-Bestimmung erfolgt daher über die teure und aufwändige
HPLC-Analytik. Eine effiziente Methode zur Selektion von Rapssorten würden
molekulare Marker bieten. Da angenommen werden kann, dass die an der
Tocopherolsynthese beteiligten Gene den Tocopherolgehalt maßgeblich bestimmen,
sind diese Sequenzen geeignete Kandidaten, um über Assoziationsstudien und
Haplotypenanalyse funktionelle Marker abzuleiten. Unter Kenntnis der Gene, die
an der Tocopherolsynthese in A. thaliana
beteiligt sind, sollten in dieser Arbeit orthologe Gene aus Raps identifiziert
werden, um diese als molekulare Marker zu kartieren. Weiter sollte die Position
der Gene im Rapsgenom mit bereits kartierten QTL verglichen werden.
Die Untersuchung des Tocopherolgehaltes von 76
Rapsherkünften aus aktuellem Zuchtmaterial ergab eine breite Variation zwischen
198 mg/kg und 510 mg/kg. Über PCR-basierte Methoden ist es gelungen für drei
der fünf direkt an der Tocopherolsynthese beteiligten Gene PDS1, APG1 und VTE4 homologe Sequenzen aus Raps zu
klonieren. Die PCR-Ergebnisse und die Southern-Hybridisierungen ergaben, dass
die drei Gene in unterschiedlicher Anzahl im Rapsgenom vorliegen. Für BnAPG1 konnte über PCR eine Sequenz
identifiziert werden, für BnPDS1 zwei
und für BnVTE4 vier Sequenzen. Die
Ergebnisse der Southern-Analyse und einer EST-Datenbankrecherche weisen darauf
hin, dass für BnAPG1 eine weitere
Kopie im Genom vorkommt. Für BnPDS1, BnAPG1 und BnVTE4 konnte die Expression nachgewiesen werden. BnPDS1 und
BnAPG1 haben eine mit den A. thaliana
Genen identische Intron/Exon-Struktur, wobei sich die Intron-Längen zwischen
den beiden Arten unterscheiden. Die BnVTE4
Sequenzen haben im Vergleich zu A. thaliana
zwei zusätzliche Introns. Der Vergleich der aus den Leserahmen abgeleiteten
Aminosäuresequenzen mit den jeweiligen A.
thaliana Sequenzen ergab Homologien von 92 % (BnPDS1), 98 % (BnAPG1) und 88
% - 90 % (BnVTE4). Die Analyse der Aminosäuresequenzen ergab, dass die
erwarteten Domänenstrukturen Glyoxalase-/ Dioxygenase-Superfamilie (BnPDS1) und
der SAM-abhängigen Methyltransferasen (BnAPG1 und BnVTE4) vorhanden waren.
Durch heterologe Expression von BnAPG1
und BnVTE4-1 in A. thaliana konnte deren angenommene Funktionen bestätigt werden.
Dazu wurden die Tocopherol-Zusammesetzungen von sechs bzw. drei T1 Familien
bestimmt. Für beide Gene konnte ein verändertes Tocopherolmuster in Samen von A. thaliana nachgewiesen werden.
Die Expression von BnVTE4-1 führte zu
einer Reduktion des γ- und δ-Tocopherol-Anteils bei gleichzeitiger
Erhöhung des α-und β-Tocopherol-Anteils. Die Expression von BnAPG1 führte zu einer Erhöhung des α-Tocopherol-Anteils bei gleichzeitiger
Reduktion des δ-Tocopherol-Anteils. Die
Sequenz BnAPG1 konnte darüber hinaus
im Abstand von 14 cM zu einem kartierten QTL für α-Tocopherol auf Chromosom N07 lokalisiert werden.
In dieser Arbeit werden zum ersten Mal funktionelle Gene für
die Tocopherolsynthese aus Raps beschrieben. Diese können nun verwendet werden,
um eine für B. napus erstellte
Kernkollektion zu untersuchen. Über Assoziationen zwischen Haplotypen und
Tocopherol-Phänotypen sollen, den Tocopherolgehalt beeinflussende, Allele
identifiziert werden, die als funktionelle Marker in der Züchtung eingesetzt
werden können
Oilseed rape is a major crop for plant oil production and therefore an important source
for vitamin E. The term vitamin E (chemically named tocochromanol) covers a
group of eight antioxidants, four tocopherols and four tocotrienols. Each group
harbours a α-, β-, γ- and δ-form. Rapeseed oil contains up to 1000 ppm tocopherol, with γ-tocopherol being the major component, followed by α- and δ-tocopherol.
For human nutrition α-tocopherol is the most important form but for oil-stability high
amounts of γ- and δ-tocopherol are needed. Thus
rapeseed cultivars with increased tocopherol content or with altered seed
tocopherol composition are desired. Until now there is no reliable non-invasive
method available for tocopherol measurement like near-infrared spectroscopy
(NIRS). Additionally this technology is not applicable to differentiate the
tocopherol components. Hence the seed tocopherol content has to be determined
by HPLC-analysis which is laborious and expensive. For selection, a
marker-assisted strategy is supposed to be an efficient method. This work was
based on the hypothesis that the genes involved in the tocopherol synthesis
directly influence tocopherol composition and accumulation. They are therefore
promising candidates for the development of functional markers which can be
used for QTL mapping and association studies. In this study, the sequence
information of known tocopherol genes from A.
thaliana was used to clone and characterize putatively orthologous genes
from B. napus. Furthermore the B. napus sequences were mapped and
compared to previously mapped QTL.
A panel of 76 rapeseed varieties was analyzed for their tocopherol content. A broad
variation ranging from 198 mg/kg to 510 mg/kg seed tocopherol was found.
PCR-based methods have been successfully used to clone homologous sequences of PDS1, APG1 and VTE4 from B. napus. The PCR-results and the
Southern analysis showed that the three genes have different copy numbers in
the B. napus genome. The copy numbers
determined by PCR, for BnAPG1, BnPDS1 and BnVTE4 were one, two and four copies, respectively. Southern as
well as EST analysis indicated the existence of one more copy for BnAPG1. For each of the B. napus tocopherol genes identified,
the expression could be demonstrated. The comparison with the A. thaliana sequences showed in
principal the same intron/exon structure for BnPDS1 and BnAPG1,
whereas the BnVTE4 sequences contain
two additional introns. The putative amino acid sequences showed 92 % (BnPDS1),
98 % (BnAPG1) and 88 % - 90 % homology to the respective A. thaliana sequences. The analysis of the amino acid sequences
revealed the expected domain structures, which are a
glyoxylase-/dioxygenase-superfamily domain for BnPDS1 and SAM-dependent
methyltransferase domains for BnAPG1 and BnVTE4. The expected function of these
genes was proven by heterologous expression of BnVTE4-1 and BnAPG1 in A. thaliana. The BnVTE4-1 and BnAPG1 were
transformed into A. thaliana using an
A. tumefaciens mediated root
transformation method. Seeds were harvested from three BnVTE4-1 T0 plants and from six BnAPG1
T0 plants, representing nine independent transformation events. The tocopherol
composition was determined by HPLC-analysis with seeds harvest from T0-Plants
(T1 generation). . Both genes led to an altered tocopherol composition in A. thaliana seeds. BnVTE4-1 caused an increase in the α-tocopherol
fraction with a simultaneous decrease in the γ-tocopherol
fraction. BnAPG1 led to higher
amounts of α-tocopherol and lower δ-tocopherol contents. Using a previously described mapping population
where tocopherol QTL had been mapped, the map position of the BnAPG1 was determined. As a result, the BnAPG1 gene had been mapped to
chromosome N07, 14 cM above a previously mapped QTL for α-tocopherol.
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