Molekulare Charakterisierung von antimikrobiellen und cytolytischen Polypeptiden von Acanthamoeba culbertsoni, einem freilebenden und potenziell humanpathogenen Protozoon

Culbicin ist ein neuartiges Peptid, welches aufgrund seiner porenbildenden Aktivität aus humanpathogenen Acanthamoeba culbertsoni isoliert wurde. Die Aufklärung der Nukleotidsequenz von Culbicin zeigte, dass das translatierte Culbicin in einem Precursor mit aminoterminalem Signalpeptid organisiert ist. Es wird postuliert, dass die Nukleotidsequenz zwischen dem 5'-Ende der Culbicinsequenz und der Signalpeptidcodierenden Sequenz ein weiteres Peptid codiert, welches KURZ genannt wurde. KURZ weist weder strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen noch zu Culbicin auf. Für beide Peptide wurde jeweils ein heterologes Expressionssystem etabliert, mit dem ausreichende Mengen der rekombinanten Peptide für die Antikörpergenerierung, Funktions- und Strukturanalysen synthetisiert wurden. Die prozentuale Verteilung der Sekundärstrukturelemente wurde untersucht und rCulbicin als ein vorwiegend α-helikales Peptid identifiziert. Die Tertiärstruktur von rCulbicin wird von fünf Disulfidbrücken stabilisiert, die dem Peptid eine enorme Stabilität unter Hitze und Säureeinwirkung verleiht. KURZ hingegen wurde als vorwiegend β-Faltblattstrukturiertes Peptid identifiziert, dessen Tertiärstruktur ebenfalls durch fünf Disulfidbrücken stabilisiert wird. Ferner wurde festgestellt, dass rCulbicin ein breites Wirkspektrum aufweist: es permeabilisiert die Membranen Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, bildet Poren in artifiziellen Liposomen, lysiert Human- und Schaf-Erythrocyten und wirkt cytotoxisch auf Candida albicans sowie zwei verschiedene humane Tumorzelllinien. Bei KURZ wurde ebenfalls antibakterielle, porenbildende und hämolytische Aktivität nachgewiesen. Mit den rekombinanten Peptiden Culbicin und KURZ wurden spezifische Antikörper generiert, die zur Immunolokalisation der natürlichen Peptide in Acanthamoeba culbertsoni-Trophozoiten verwendet wurden. Natürliches Culbicin wurde in cytosolischen Granula der Trophozoiten nachgewiesen, KURZ hingegen konnte nicht lokalisiert werden. Mit dem spezifischen Anti-Culbicin-Antikörper wurde im Immunoblot ein Protein von Acanthamoeba castellanii erkannt, bei dem es sich vermutlich um ein Culbicin-Ortholog handelt. Die Analyse einer online-cDNA-Bank von A. castellanii untermauert dieses Postulat, da eine translatierte cDNA-Sequenz 93 % Ähnlichkeit zur Culbicinsequenzaufweist. Dieses Culbicin-Ortholog, welches in dieser Arbeit den Arbeitstitel Castellanicin erhielt, ist gleichfalls in einem Precursor organisiert. Die Aminosäuresequenz des gesamten Castellanicin-Precursors ist der des Culbicin-Precursors zu 71 % ähnlich. Aufgrund dessen wird postuliert, dass mit Culbicin und KURZ sowie deren Homologen von Acanthamoeba castellanii in dieser Arbeit zwei gänzlich neue Proteinfamilien entdeckt wurden, die keine strukturellen Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinfamilien aufweisen.

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