Systematic evaluation of the effect of common SNPs onpre-mRNA splicing

Background: The evolutionary and biomedical importance of differential mRNA splicing is well established, especially with regard to pathophysiological conditions. Up to 60% of mutations that contribute to disease development have been proposed to do so by disrupting splicing events. Erroneous splice site usage is also observed in numerous diseases. Problem: Identification and functional annotation of single-nucleotides polymorphisms that interfere with splicing mechanisms (‘splice SNPs') is a major challenge and needs to be supported by an efficient method. Solution: 1) A high-throughput methodology was established to facilitate the screening of allele-dependent splicing in a high-throughput fashion (ElSharawy et al., 2006). The method integrated a package of four new software tools and was mainly based on using a panel of 92 matched pairs of individual-specific gDNA and cDNA samples. For each SNP, 16 cDNAs providing a balanced representation of the genotypes at the respective SNP were investigated by nested RT-PCR and subsequent sequencing. Putative allele-dependent splicing events were verified by cloning and sequencing. 2) A systematic, SNP-centered approach was followed and the database dbSNP was screened to filter a group of common SNPs at either canonical splice sites or ESEs that were classified as putatively splicing-relevant by bioinformatics tools. This was completed in two screening rounds using web-based tools (Alex’s splice site score calculator and ESEfinder) and neural network, respectively. A group of SNPs at NAGNAG tandem repeat sites was also tested (ElSharawy et al., 2008). Results and conclusion: As a result of genotyping, the 223 non-redundant candidate SNPs were experimentally tested, and 18 allele-dependent splicing events were identified, of which 15 were novel and 3 exhibited an already known functional relevance. However, the positive predictive value of the bioinformatics tools turned out to be low, ranging from 0% for ESEFinder to 9% (in the case of acceptor site SNPs) for the neural network. Overall, the currently available bioinformatics tools contribute little to the understanding as to how common genetic variation impacts mRNA splicing. Therefore, there is a need for an alternative system. A proof of concept and outlook: The present study made some preliminary steps to develop a novel in vitro fluorescence-based splice reporter system. The ongoing systematic and hypothesis-driven experiments, which combine the advantages of FACS-based reporter constructs with a dichromatic readout method (a defined and experimentally controlled system) and ultra-high-throughput second generation sequencing technology, will serve to establish an efficient means to address many splice-related topics, and thus, would improve our understanding of mammalian splice site anatomy.

Hintergrund: Die weitreichende evolutionäre und physiologische Bedeutung des differentiellen mRNA-Spleißens ist allgemein bekannt, besonders im Hinblick auf pathophysiologische und biomedizinische Fragestellungen. Man geht davon aus, dass bis zu 60 Prozent aller krankheitsverursachenden Mutationen auf eine Zerstörung von Spleißstellen zurückzuführen sind. Eine fehlerhafte Nutzung von vorhandenen Spleißstellen ist bereits für eine Vielzahl von Krankheiten bekannt. Problemstellung: Die Identifizierung und funktionelle Annotation spleißrelevanter SNPs stellt eine große Herausforderung dar und bedarf der Unterstützung durch eine effiziente Methodik. Lösungsansatz: 1)Zur Erleichterung des Screenings nach allelabhängigen Spleißereignissen wurde eine neue Hochdurchsatzmethodik entwickelt (ElSharawy et al., 2006). Diese umfasst vier neue Software-Anwendungen und basiert hauptsächlich auf der Nutzung eines Panels von 92 übereinstimmenden Paaren individuenspezifischer gDNA- und cDNA-Proben. Für jeden der zu untersuchenden SNPs wurden 16 cDNAs mittels RT-PCR und anschließender Sequenzierung untersucht. Allelabhängige Spleißereignisse wurden durch Klonierung und Sequenzierung verifiziert. 2)In einem systematischen, SNP-zentrierten Ansatz wurden häufige SNPs an kanonischen Spleißstellen sowie an ESEs aus dbSNP gefiltert und mittels webbasierter Anwendungen als potentiell spleißrelevant klassifiziert. In einem zweiten Ansatz erfolgte die Klassifizierung der SNPs mittels eines neuronalen Netzwerkes. Die als spleißrelevant klassifizierten SNPs wurden im Anschluß mit der oben beschriebenen Methode untersucht. Zusätzlich wurde eine Gruppe von SNPs an NAGNAG Tandems Repeats getestet (ElSharawy et al., 2008). Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Insgesamt wurden 223 nicht redundante Kandidaten-SNPs experimentell getestet. Dabei wurden 18 allelabhängige Spleißvorgänge identifiziert, von denen 15 neuartig waren und für 3 die funktionelle Relevanz bekannt ist. Dabei stellte sich die korrekte positive Vorhersagefähigkeit der bioinformatischen Tools als äußerst gering heraus - von 9% (für Spleißakzeptor-SNPs) für das neuronale Netzwerk bis zu 0% für den „ESEFinder“. Zusammenfassend konnten die verwendeten bioinformatischen Anwendungen nur wenig zum Verständnis beitragen, wie häufige genetische Variationen das mRNA-Spleißen beeinflussen. Ausblick: In der vorliegenden Arbeit wurden entscheidende vorläufige Schritte zur Entwicklung eines neuartigen fluoreszenzbasierten in vitro-Spleißreportersystems geleistet, welches zur Zeit getestet und im Hinblick auf gezielte Fragestellungen validiert wird. Die momentan durchgeführten systematischen und hypothesenorientierten Experimente kombinieren die Vorteile FACS-basierter dichromatischer Reportersyteme mit denen der Hochdurchsatz-Sequenziertechnologie (second generation sequencing technology) und könnten ein effizientes Mittel zur Aufklärung vieler spleißrelevanter Fragestellungen darstellen und unser Verständnis des allelabhängigen Spleißens entscheidend verbessern.

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