Development of calcium phosphate based drug delivery systems for local application of zoledronic acid

Calcium phosphate-like bone substitute materials have a long history of successful orthopaedic applications such as bone void filling and augmentation. Based on the clinical indications, these materials may be loaded with active agents by adsorption offering a perspective for providing innovative drug delivery systems. The highly effective antiporotic, nitrogen-containing, bisphosphonate zoledronic acid (ZOL) demonstrated a strong affinity to calcium phosphates. It has been shown to significantly impact anabolic and catabolic pathways in bone remodelling towards reduction of osteoclast activity. The effects of locally applied ZOL on the early bone formation are of scientific and therapeutic interest, but still not fully understood. The local application of ZOL on implants is considered to support implant stabilisation by reducing early bone resorption. Support of early bone formation and reduction of bone resorption can be expected after implantation of bioceramics releasing ZOL. The aim of the present thesis was to develop a feasible method for combining ZOL with bone substitutes by use of a dipping technique. The properties of three different materials (sintered body, granules and powder) were investigated to evaluate their potential as drug carriers for ZOL. This included the use of a range of physico-chemical methods such as light microscopy, scanning electron microscopy (SEM), true density, surface area measurement, dynamic vapour sorption (DVS), and pH value determination. In addition to the physico-chemical characterisation, the bone substitutes were evaluated for their ZOL loading capacity (time and concentration). Also, the materials were assessed as release systems in an in vitro study. Furthermore, ZOL stability under different storage conditions, cytotoxicity of ZOL with a cell line and a characterisation of modified cement formulations were performed to design a suitable implant for an animal model. In an in vivo study, ZOL was released from a drug-loaded preshaped calcium phosphate bone cement plug, which was implanted into a bone defect in the proximal tibia of rats. The aim was to gain experience about the short term effects of ZOL on bone implant contact, bone regeneration and bone area. In a short term investigation, one and three weeks post operationem, tissue reactions as well as bone regeneration capabilities at the implant site were investigated by means of histological and imaging analysis. Furthermore, tissue samples, harvested at placebo and verum plug sites were used to analyse the gene expression of selected bone-specific markers. Levels of osteocalcin (OC), alkaline phosphatase (ALP), cathepsin K (CATK), tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNFα) were determined by using quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Data were normalized against 18S and GAPDH ribosomal subunits. The results of the present thesis indicated differences between the bone substitute materials used and their potential use as a local drug delivery system in terms of physico-chemical properties, drug adsorption and release profiles. The in vitro investigations demonstrated a controlled ZOL load in a range of 0.04 – 1.86 µg/mg material and a release of 0.02 – 0.18 µg/mg within 30 minutes. The findings of the in vivo study showed that in the placebo interface a higher amount of cells could be detected as indicated by higher expression of small subunit ribosomal RNA (18S). Nevertheless, comparing the normalized data of the selected gene expression levels, no significant differences were detected. Histopathological analysis revealed no adverse tissue effects and provided evidence of biocompatibility for both implant types. The histomorphometric results showed a significantly higher bone to implant contact and bone area for ZOL loaded bone cement plug at three weeks after implantation. The study showed some significant differences in the biological tissue response to loaded and non-loaded bone cement plugs. In this model, ZOL was demonstrated to be effective in impacting the bone regeneration process towards reduction of early bone resorption and enhanced bone formation.

Calciumphosphat-basierte Knochenersatzmaterialien werden seit langem erfolgreich in der Orthopädie zur Füllung von Knochendefekten und zum Knochenaufbau eingesetzt. Diese Materialien könnten, je nach klinischer Indikation, durch Adsorption mit Arzneistoffen beladen werden, was eine Perspektive für innovative arzneistofffreisetzende Systeme darstellt. Das hochpotente, antiporotisch wirkende, stickstoffhaltige Bisphosphonat Zoledronsäure (ZOL) weist eine hohe Affinität zu Calciumphosphaten auf. Der Arzneistoff hat bereits einen signifikanten Einfluss auf anabole und katabole Stoffwechselvorgänge während des Knochenumbaus hin zu einer reduzierten Osteoklastenaktivität gezeigt. Die Effekte von lokal applizierter ZOL auf die frühe Knochenneubildung sind von wissenschaftlichem und therapeutischem Interesse, bisher aber noch nicht vollständig verstanden. Eine gezielte, lokale Applikation von ZOL mit Hilfe eines Calciumphosphatträgers könnte zu einer verminderten Knochenresorption und einer erhöhten Knochenneubildung führen, wodurch ein Implantat gerade in einer frühen Heilungsphase stabilisiert werden könnte. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, eine einfach durchzuführende Beladungstechnik von Knochenersatzmaterialien mit ZOL zu entwickeln. Die Eigenschaften von drei verschiedenen Knochenersatzmaterialien wurden mit Hilfe einer Vielzahl von physiko-chemischen Methoden wie z.B. Lichtmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie, Dichtebestimmungen, Oberflächenbestimmungen, dynamischer Wassersorption und pH-Wert Bestimmungen charakterisiert, um die Möglichkeiten eines potenziellen Arzneistoffträgers zu ermitteln. Neben der physiko-chemischen Charakterisierung wurden die ZOL Beladungskapazitäten der verschiedenen Materialien zeit- und konzentrationsabhängig ermittelt. Zusätzlich wurden die in vitro Freisetzungskinetiken der beladenen Materialien bestimmt. Des Weiteren wurde die ZOL Stabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen, die Zytotoxizität auf eine Zelllinie und die Charakterisierung von modifizierten Zementformulierungen experimentell getestet, um ein geeignetes Implantat für einen Tierversuch zu entwickeln. In einer in vivo Studie wurde ZOL aus einem vorgeformten, arzneistoffbeladenen Calciumphosphat-Knochenzementimplantat freigesetzt, welches in die proximale Rattentibia implantiert wurde. Das Ziel war es, Kenntnis über die kurzeitigen Effekte von ZOL in Bezug auf die Knochenimplantatkontaktfläche, die Knochenregeneration und die Knochenfläche zu erlangen. Innerhalb des Untersuchungszeitraumes von ein und drei Wochen nach Operation wurden sowohl Gewebereaktionen als auch Knochenregenerationsmöglichkeiten mit Hilfe von histologischen und bildgebenden Analysen untersucht. Ergänzend wurden Gewebeproben, die von Placebo- und Verumimplantaten entnommen wurden, einer Genexpressionsanalyse von ausgewählten knochenspezifischen Markern unterzogen. Die Konzentrationen von Osteocalcin (OC), Alkaliphosphatase (ALP), Kathepsin K (CATK), Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP), Interleukin-1β und Tumornekrosefaktor α wurden über ein quantitatives Polymerasekettenreaktionsverfahren (qPCR) bestimmt. Die Daten wurden gegen 18S und GAPDH ribosomale Untereinheiten normalisiert. Die Ergebnisse der physiko-chemischen Untersuchungen, der Arzneistoff-adsorption und der Freisetzungskinetiken der vorliegenden Arbeit zeigten Unterschiede der verwendeten Knochenersatzmaterialien im Gebrauch als lokales, arzneistofffreisetzendes System. Die in vitro Untersuchungen präsentierten die Möglichkeit einer kontrollierten ZOL Beladung in einem Bereich von 0,04 – 1,86 µg/mg der jeweiligen Materialen und eine Freisetzung von 0,02 – 0,18 µg/mg innerhalb von 30 Minuten. Die Ergenisse der in vivo Studie zeigten, dass eine vermehrte Zellzahl an der Placebokontaktfläche ermittelt werden konnte, was aus einer höheren Expression der 18S RNA Untereinheit geschlussfolgert wurde. Beim Vergleich der normalisierten Daten der Genexpression konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden. Eine histopathologische Auswertung ergab, dass keine nachteiligen Gewebereaktionen für beide Implantattypen nachgewiesen werden konnten, was die Vermutung einer guten Biokompatibilität unterstützt. Die histo-morphometrischen Ergebnisse demonstrierten eine signifikant erhöhte Knochen-Implantat-Kontaktfläche und Knochenfläche für die ZOL-beladenen Implantate nach drei Wochen. Zusammengefasst konnten mit Hilfe der durchgeführten Tierstudie signifikante Unterschiede in der biologischen Gewebeantwort von ZOL-beladenen Knochenzementimplantaten gezeigt werden. In dem verwendeten Modell beeinflusste ZOL den Knochenregenerationsprozess hin zu einer Verringerung der frühen Knochenresorption und einer erhöhten Knochenneubildung.

Rights

Use and reproduction:

No license. The provisions of the German Copyright Act (UrhG) apply.

Please note that individual components of the publication may be subject to other licensing or copyright conditions.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.