Untersuchung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität von humanisierten EGF-Rezeptor-Antikörpern mit optimiertem Antikörper-Fc-Fragment gegen Tumorzellen mit mutiertem KRAS-Protein

Mutationen im Codon 12 bzw. 13 des KRAS-Gens in Tumorzellen des kolorektalen Karzi-noms (CRC) gelten als ungünstiger prognostischer Biomarker für die Therapie mit den mo-noklonalen EGFR-Antikörpern Cetuximab (Erbitux®) und Panitumumab (Vectibix®). Derselbe Zusammenhang wird für Patienten diskutiert, die an einem nicht-kleinzelligen Lungenkarzi-nom (NSCLC) erkrankt sind und im Rahmen klinischer Studien mit dem monoklonalen EGFR-Antikörper Cetuximab behandelt werden. In dieser Arbeit wurde daher der Frage nachgegangen, inwiefern sich Mutationen von KRAS auf die Wirksamkeit monoklonaler EGFR-Antikörpern in vitro auswirken und ob diese Auswirkungen durch die Optimierung der Fc-Region der Antikörper beeinflusst werden können. Hierzu wurden kultivierte Tumorzelllinien des kolorektalen Karzinoms (HCT-116, SW-480) sowie des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (A549, H2030), die eine Mutation des KRAS-Gens im Codon 12 bzw. 13 aufweisen in Zytotoxizitäts- und Wachstumsinhibitionsversuchen untersucht. Als Referenz diente die Plattenepithelkarzinom-Zelllinie A431, die einen KRAS-Wildtyp aufweist. Verwendet wurden humanisierte Varianten des monoklonalen IgG1 EGFR-Antikörpers Cetuximab. Es konnte gezeigt werden, dass die im Fc-Teil unveränderte huma-nisierte Antikörpervariante von Cetuximab (Wildtyp-IgG1) die KRAS-mutierte Zelllinie A549 im Vergleich mit der Zelllinie A431 nicht im Wachstum hemmte, jedoch in der Lage war, diese mittels ADCC durch mononukleäre Zellen abzutöten. Um zu untersuchen, ob sich der ADCC durch Modifikationen des Fc-Fragments in seiner Intensität steigern lässt, wurden drei weitere Varianten dieses Antikörpers hergestellt, deren Fc-Fragmente mittels Proteinengineering (I332E und S239D/I332E) oder Glykoengineering (unfucosyliert) für den ADCC optimiert wurden. Die Charakterisierung dieser Antikörpervari-anten zeigte verglichen mit dem Wildtyp-IgG1 eine deutlich höhere Affinität zum FcRIIIa bei identischer Affinität des Fab-Fragments zum EGFR. Darüber hinaus zeigte sich, dass die KRAS-unmutierte Zelllinie A431 von den Antikörpervarianten gleichermaßen im EGFR-abhängigen Wachstum gehemmt wurde. In Zytotoxizitätsversuchen sowohl mit isolierten mononukleären Zellen als auch im Vollblut erwiesen sich die Antikörpervarianten jedoch als signifikant effektiver gegenüber dem Wildtyp-IgG1. Bei der Untersuchung der KRAS-mutierten Tumorzelllinien des kolorektalen Karzinoms sowie des nicht-kleinzelligen Lungen-karzinoms im Zytotoxizitätstest zeigte sich eine signifikante Steigerung der ADCC durch die optimierten Antikörpervarianten im Vergleich zum Wildtyp-IgG1. Die Konzentration der Anti-körpervarianten, die erforderlich war um die Hälfte der Tumorzellen abzutöten (EC50), war darüber hinaus signifikant niedriger als die des Wildtyp-IgG1. Ferner ließen sich Tumorzellen abtöten, die zuvor resistent gegenüber ADCC durch den Wildtyp IgG1 waren. Einen weiteren Aspekt stellte der Einfluss von FcR Polymorphismen auf den ADCC dar. IgG1 Antikörper binden mit hoher Affinität an den FcRIIIa, von dem zwei polymorphe Alloty-pen (FcRIIIa-158V und -158F) existieren, und der auf Natürlichen Killerzellen exprimiert wird. Natürliche Killerzellen, eine Subpopulation der Lymphozyten, sind wichtige Effektorzellen für den ADCC im menschlichen Organismus. Durch die Modifikation der Fc-Fragmente der Antikörper, wurde ihre Affinität zum FcRIIIa erhöht, unabhängig vom Allotyp des Rezeptors. Im Zytotoxizitätstest gegen die KRAS-mutierte Tumorzelllinie des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms A549 konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Antikörpervarianten gegenüber dem Wildtyp-IgG1 unabhängig vom Allotyp des Rezeptors eine verbesserte ADCC induzierten.

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