@PhdThesis{diss_mods_00013310, author = {Stephan, Mario}, title = {Molekularer Mechanismus der Fas Ligand-induzierten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase}, year = {2013}, publisher = {Christian-Albrechts-Universit{\"a}t zu Kiel}, address = {Kiel}, keywords = {Saure Sphingomyelinase}, abstract = {Das endo-lysosomale Enzym saure Sphingomyelinase (A-SMase) ist ein wichtiges Element der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose. Im CD95-Signalweg ist die Translokation der A-SMase zur {\"a}u{\ss}eren Zellmembran von besonderer Bedeutung. An der Zelloberfl{\"a}che katalysiert die A-SMase die Hydrolyse von Sphingomyelin und erm{\"o}glicht die Bildung von Ceramid-angereicherten Membrandom{\"a}nen. Dies bewirkt das Clustern des CD95-Rezeptors, eine verst{\"a}rkte Rekrutierung der Adaptorproteine FADD und Caspase 8 sowie die Induktion einer apoptotischen, proteolytischen Kaskade. Jedoch ist bisher unbekannt, ob der A-SMase w{\"a}hrend der Rezeptor-Internalisierung eine weitere Funktion in der CD95-Signaltransduktion zukommt. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit die Internalisierung des CD95-Rezeptors zu analysieren und eine enzymatisch aktive A-SMase in den CD95-enthaltenden Endosomen (Rezeptosomen) nachzuweisen. Die magnetische Isolierung des zu unterschiedlichen Zeitpunkten internalisierten CD95-Rezeptors erm{\"o}glichte eine zeitabh{\"a}ngige Analyse der Rekrutierung von Adaptorproteinen. In der Western-Blot Analyse lie{\ss} sich mit dem verst{\"a}rkten Auftreten von FADD und Caspase 8 die Bildung des DISC (death-inducing signaling complex) nachweisen. Die Detektion Kompartiment-spezifischer Markerproteine veranschaulichte zudem die Fusion zwischen CD95-Rezeptosomen und Rab 4A- oder Cathepsin D-positiven Vesikeln. Dar{\"u}ber hinaus lie{\ss} sich mit verschiedenen methodischen Ans{\"a}tzen eine biphasisch aktivierte A-SMase in den magnetischen Fraktionen identifizieren. Der erste Aktivit{\"a}tsanstieg korrelierte mit einer verst{\"a}rkten Translokation der A-SMase an die Zelloberfl{\"a}che und konnte durch den Caspase 8-Inhibitor IETD blockiert werden. Die Inhibition der CD95-Internalisierung durch den Dynamin-Inhibitor Dynasore reduzierte dagegen den zweiten Aktivit{\"a}tsanstieg der A-SMase in den CD95-Rezeptosomen. Auf Grundlage dieser Inhibitionsversuche lie{\ss} sich das biphasische Aktivit{\"a}tsprofil mit der Caspase 8-abh{\"a}ngigen Translokation der A-SMase zur Plasmamembran sowie mit der anschlie{\ss}enden CD95-Internalisierung in Verbindung setzen. Interessanterweise f{\"u}hrte auch die Behandlung mit dem Caspase 3/7-Inhibitor DEVD zu einer Inhibition des zweiten Aktivit{\"a}tsanstiegs der A-SMase. Weitere Analysen zeigten, dass Caspase 3 und 7 in den CD95-Rezeptosomen angereichert sind und direkt mit der A-SMase interagieren. In vitro lie{\ss} sich zudem die Caspase 3- und 7-vermittelte proteolytische Aktivierung der A-SMase nachweisen. Diese Ergebnisse lassen somit darauf schlie{\ss}en, dass der zweite Aktivit{\"a}tsanstieg der A-SMase auf einem Caspase 3- oder 7-abh{\"a}ngigen Aktivierungsmechanismus in internalisierten CD95-Rezeptosmen beruht.}, url = {https://macau.uni-kiel.de/receive/diss_mods_00013310}, file = {:https://macau.uni-kiel.de/servlets/MCRFileNodeServlet/dissertation_derivate_00005090/Diss_Mario%20Stephan.pdf:PDF}, language = {de} }