Freisetzung bioaktiver Peptide aus Milchproteinen durch proteolytische Enzyme von Milchsäurebakterien : Klonierung und Expression zweier zellwandgebundener Proteasen

Bioaktive Peptide kommen sehr oft in Milchprotein vor und sind innerhalb der Milchproteinsequenz inaktiv. Die Freisetzung bioaktiver Peptide aus Milchprotein kann durch Proteolyse von proteolytisch aktiven Bakterien erfolgen. Aus den beiden proteolytisch aktiven Stämmen: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 92059 und Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis 92202 konnte jeweils ein Proteasegen isoliert und kloniert werden. Aus den Proteasegenen der beiden Stämme wurden jeweils zwei unterschiedliche Varianten für die Expression in Escherichia coli hergestellt. Für die Expression in Lactococcus lactis mit Hilfe des NICE-Systems wurden pro Protease zwei weitere N-terminale Varianten konstruiert. In E. coli konnte für keines der exprimierten Protease-Derivate proteolytische Aktivität nachgewiesen werden. In L. lactis konnten für beide Proteasen insgesamt vier aktive Derivate in löslicher Form exprimiert werden. Mittels Ni2+-NTA Säule konnten die Derivate PrtBb und PrtB2 der Protease aus dem Stamm 92059, die einen His-Tag enthielten, gereinigt werden. Im Gegensatz dazu waren die gereinigten Protease-Derivate PrtB7 und PrtB1 aus dem Stamm 92202 proteolytisch nicht aktiv. Die gereinigten Protease-Derivate PrtBb und PrtB2 besaßen Molekulargewichte von 183,1 kDa bzw. 171,9 kDa. Der isoelektronische Punkt des PrtBb lag bei 5,19 und der des Prtb2 bei 5,12. Beide Enzymderivate arbeiteten optimal bei 37-40°C und bei pH 6,2-7,2. Sie waren in der Lage Casein zu hydrolysieren. In den Caseinhydrolysaten, die durch die beiden Protease-Derivate PrtBb und PrtB2 hergestellt wurden, wurden jeweils 32 Peptide mit einer Länge von 4-18 Aminosäuren detektiert und mittels Massenspektrometrie identifiziert. Beide Hydrolysate enthielten exakt die identischen Peptide. Für die Caseinhydrolysate konnten Bioaktivitäten wie Angiotensin-I-Converting Enzyme (ACE) -Inhibierung, anti-inflammatorische und antimikrobielle Aktivität nachgewiesen werden.

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