Assemblierung und Pharmakologie von spannungsabhängigen KCNQ (Kv7) K+ Kanälen

Beimgraben, Christian

Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass für eine erfolgreiche Interaktion der KCNQ Untereinheiten der carboxyterminale Bereich der Kanäle verantwortlich ist. Sowohl die homomere, als auch die heteromere Assemblierung der KCNQ Kanäle wird dabei durch die beiden coiled coil Domänen im Bereich der si-Domäne vermittelt, wobei die zweite coiled coil Domäne einen verstärkten Einfluss auf die Heteromerisierung der KCNQ Kanäle ausübt. Untersuchungen zur Assemblierung des heteromeren KCNQ2/KCNQ3 Kanals ergaben eine verstärkte Oberflächenexpression, die eventuell in Zusammenhang mit einem gesteigerten Transport an die Zelloberfläche steht und daher möglicherweise durch die zweite coiled coil Domäne der KCNQ Kanäle vermittelt wird. In der Nähe der zweiten coiled coil Domäne von KCNQ5 befindet sich eine putative PKA abhängige Phosphorylierungsstelle, von der daher vermutet wurde, dass diese einen Einfluss auf die Assemblierung von KCNQ5 oder auf den heteromeren Kanal KCNQ3/KCNQ5 ausüben könnte. Jedoch konnte durch in vitro Experimente zur putativen PKA abhängigen Phosphorylierung von KCNQ5 keine selbige beobachtet werden. Elektrophysiologische Untersuchungen ergaben dagegen für den durch Punktmutation veränderten Kanal von KCNQ5 mit einem Glutamatrest an Stelle der putativen PKA Phosphorylierung einen verstärkten Strom, so dass möglicherweise andere Phosphorylierungen oder bisher unbekannte Modifikationen von KCNQ5 für den beobachteten Effekt verantwortlich sind. Darüber hinaus konnte für KCNQ3 ein zusätzlicher 65 Aminosäuren großer carboxyterminaler Bereich identifiziert werden, der ebenfalls für einen verstärkten Strom des im Rahmen dieser Arbeit untersuchten chimären Kanals mit dem Proteinrückgrat von KCNQ4 und dem C-Terminus von KCNQ3 verantwortlich ist. Die Ursache für diese verstärkten Ströme ist noch ungeklärt, basiert aber möglicherweise auf einer ebenfalls erhöhten Oberflächenexpression des chimären KCNQ3/KCNQ4 Kanals. Für zusätzliche in vivo Untersuchungen zur endogenen Stöchiometrie heteromerer KCNQ2/KCNQ3 Kanäle wurden spezifische Antikörper benötigt, die endogenes KCNQ2 und KCNQ3 erkennen. Die neu synthetisierten polyklonalen Antikörper gegen KCNQ2 und gegen KCNQ3 erkannten nur das in COS-7 Zellen überexprimierte Protein von KCNQ2 und KCNQ3. Für Membranpräparate aus dem Gehirn von Mäusen, sowie für die neuronale Zellkultur NG-10815 konnte dabei jedoch kein endogenes KCNQ2 oder KCNQ3 nachgewiesen werden. Untersuchungen an KCNQ1/KCNQ3 Chimären ergaben im Gegensatz zu den verstärkten Strömen der KCNQ3/KCNQ4 Chimären, dass die Porenregion von KCNQ3 vermutlich regulierend auf die in Xenopus Oozyten beobachteten Ströme wirkt. Hingegen bewirkt die Porenregion von KCNQ1 einen verstärkten Strom für injizierte Xenopus Oozyten. Chimären von KCNQ2, KCNQ4 und KCNQ5, bei denen die Pore gegen die Porenregion von KCNQ1 mit der bereits bekannten N-Glykosylierungsstelle ausgetauscht wurde, zeigten ebenfalls in elektrophysiologischen Experimenten deutlich verstärkte Ströme im Vergleich zu den unveränderten Kanälen von KCNQ2, KCNQ4 und KCNQ5. Obwohl eine N-Glykosylierung von KCNQ1 im Western Blot für transfizierte COS-7 Zellen nicht beobachtet wurde, könnte daher dennoch eine N-Glykosylierung von KCNQ1 für den stromverstärkenden Effekt der Porenregion von KCNQ1 verantwortlich sein. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Benzodiazepin R-L3 nicht nur stimulierend auf KCNQ1, sondern ebenfalls auf KCNQ5 wirkt. Jedoch scheint der heteromere Kanal von KCNQ5 und KCNQ3 nicht von R-L3 beeinflusst zu werden. Elektrophysiologische Untersuchungen für KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4, sowie des heteromeren Kanals von KCNQ2 und KCNQ3 ergaben keine signifikante Veränderung nach Behandlung mit R-L3. Zusammenfassend konnte in elektrophysiologischen und in pharmakologischen Untersuchungen zu spannungsabhängigen KCNQ Kanälen gezeigt werden, dass der carboxyterminale Bereich entscheidend für die erfolgreiche Assemblierung von KCNQ Kanälen ist und dass neben KCNQ1 die weitere Untereinheit KCNQ5 mit Hilfe von R-L3 stimuliert werden kann.

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Beimgraben, Christian: Assemblierung und Pharmakologie von spannungsabhängigen KCNQ (Kv7) K+ Kanälen. 2007.

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