An evaluation of the effect of food quality on heterotrophic protists with a critical assessment of a new measuring technique (Flow CAM)

Hantzsche, Florian Matthias

In this thesis the Flow CAM is examined for possible applications in the field as well as for experimental setups under controlled conditions. The Flow CAM is supposed to replace tedious, traditional methods like microscopic counting in planktological surveys. The daily routine sampling and measurement program of important parameters such as microscopic counts and chlorophyll measurements at the sampling station “Helgoländer Reede” provide the best background against which to test the reliability of Flow CAM measurements. The expectation on this technology was high since the Flow CAM, in contrast to other particle counters, takes pictures of each particle. Thus, it is possible not only to measure the distribution of particles in water samples but also enables the identification of each particle. Each captured particle on the digitalized picture is characterized by twenty Flow CAM parameters (e.g. length, width, fluorescence) assigned to it. This kind of particle signature is supposed to help to identify such a particle in new subsequent measurements, which would shorten time for particle quantification tremendously. In some cases this might be possible. The results presented here, however, show that much more effort has to be used for appropriate data acquisition with the Flow CAM. Therefore, several factors are illustrated in Chapter II which determine the accuracy of Flow CAM measurements in the fluorescence triggered image mode, such as camera and fluorescence settings which are of great importance in this measurement mode. Particles are potentially not photographed, and thereby missed, because they are not recognized by the camera or because their fluorescence is too low. The most serious factors which determine the measurement success of the Flow CAM are particle concentration and pump speed. The ability of the Flow CAM to measure the fluorescence of particles is not absolute but rather dependent on pump speeds. The Flow CAM performance on field samples is presented in Chapter III. In order to be able to measure the wide size range of phytoplankton and microzooplankton, three different flowcell sizes were used. All of these were measured in two of the three available measurement modes, the AutoImage and the fluorescence triggered image mode. The results in the AutoImage mode showed that the Flow CAM measures particle densities correctly. The main proportion of these particles, however, consisted almost exclusively of detritus. The fluorescence triggered image mode, which is supposed to measure fluorescent particles selectively, captured also a large amount of detritus due to co-captures of fluorescent particles. In comparison to microscopic counts the Flow CAM underestimates the abundances of plankton species in most cases. This is due to the relatively high threshold of the fluorescence detector and the different pump speeds which were used to increase the contact probability with fluorescent particles. The effect of food quality on the phagotrophic flagellate Oxyrrhis marina is presented in Chapter IV. Up to date little is known about how such primitively single-celled heterotrophs are affected. Feeding experiments showed that O. marina does not distinguish between food of different qualities; feeding seemed to be food quality independent. The growth rate, however, was lower when O. marina was fed with phosphorus depleted food. Nitrogen depleted food on the other hand had no effect on growth. The attempt to explain this by comparing enhanced respiration rates failed since O. marina fed nitrogen or phosphorus depleted food respired at similarly ehanced rates to excrete the surplus carbon. Therefore, the elemental phosphorus may be the limiting element for such fast growing heterotrophs. The extent to which O. marina select between different food qualities depending on its precondition is presented in Chapter V. For this purpose the Flow CAM was used to discriminate between phosphorus and nitrogen depleted food. O. marina, however, did not feed selectively but rather reacted with different ingestion rates depending on its precondition. When O. marina fed in single food treatments containing that element which was limiting in its precondition treatment, O. marina reacted with compensatory feeding. This shows that O. marina can perceive the limiting nutrient in its own cell as well as in the nutrient composition of its food source. The the fact that O. marina continued feeding on the food source with which it was fed before indicated that post-gut ingestion play a higher role in O. marina than pre-gut ingestion. This present thesis is aimed at revealing some of the weak points of the Flow CAM. These shortcomings are to be further identified in order to ensure that the Flow CAM can possibly be used for automatic counting processes in the future. The role which heterotroph protists can play in the food web and the effect food of different qualities can have on them is shown in the experiments presented here using the model organism O. marina. Further investigations are needed to establish whether these results can be transferred to other protists.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich sowohl mit der Einsetzbarkeit der Flow CAM für planktologische Untersuchungen im Feld, als auch für experimentelle Fragestellungen unter kontrollierten Laborbedingungen. Ursprünglich war die Flow CAM als geeignetes Hilfsmittel gedacht, Wasserproben und deren Planktonbestandteile in kürzester Zeit zu messen, um gegebenenfalls die zeitintensiven, traditionellen Zählmethoden mit dem Mikroskop abzulösen. Die langen Erfahrungen und die täglichen Arbeiten an der Helgoländer Messstation „Reede“ sollten deshalb beste Voraussetzungen bieten, um die Fähigkeiten der Flow CAM mit einigen Routineparametern (z.B. Mikroskopzählungen und Chlorophyll-Messungen) zu vergleichen und ihre Glaubwürdigkeit zu testen. Große Erwartungen wurden in die Flow CAM gesetzt, da sie im Vergleich zu bisherigen Partikelzählern digitale Bilder macht, die es qualitativ ermöglichen, Verteilungsmuster von erkennbaren Partikeln zu bestimmen. Jeder digital erfasste Partikel erhält eine Art Signatur bestehend aus zwanzig verschiedenen Flow CAM Parametern (z.B. Länge, Breite, Fluoreszenz), die es theoretisch ermöglichen sollten eine Gruppe oder eine Art eindeutig zu charakterisieren. Anhand der Signatur sollte es in erneuten Messungen leicht möglich sein die so definierten Partikel wieder zu finden, was eine Quantifizierung enorm vereinfachen würde. In manchen Fällen dürfte dies auch funktionieren, jedoch zeigen die hier vorliegenden Ergebnisse, dass eher darauf zu achten ist, wie die Flow CAM in den einzelnen Messmodi Partikel misst, um glaubhafte Zähldaten überhaupt zu erhalten. In Kapitel II werden deshalb verschiedenste Faktoren präsentiert, die die Flow CAM Ergebnisse im Fluoreszenz-Modus enorm beeinträchtigen. Dazu zählen bestimmte Einstellungen der digitalen Kamera bzw. Einstellungen des Fluoreszenz-Detektors, die für diesen Messmodus sehr wichtig sind. Es besteht die Gefahr, dass Partikel deshalb nicht fotografiert werden, weil sie entweder von der Kamera nicht erkannt werden oder weil sie zu wenig Fluoreszenz besitzen. Viel wichtiger sind aber noch die Auswirkungen von Partikeldichten und Pumpgeschwindigkeiten, die über den Erfolg der Flow CAM Messungen entscheiden. Zudem darf die gemessene Fluoreszenz von einem Partikel nicht als absolute Fluoreszenz gewertet werden, sondern ist auch hier abhängig von der Pumpgeschwindigkeit. In Kapitel III wird die Fähigkeit der Flow CAM im Feld unter Beweis gestellt. Um das gesamte Größenspektrum des Phytoplanktons und Mikrozooplanktons abdecken zu können, mussten drei verschiedene Größenfraktionen gemessen werden. Alle drei Größen wurden mit zwei der drei möglichen Messmodi der Flow CAM gemessen (AutoImage Modus und Fluoreszenz-Modus). Die Ergebnisse zeigen, dass der AutoImage modus der Flow CAM zur Bestimmung der Gesamtpartikelkonzentration im Wasser zuverlässige Ergebnisse erzielt. Jedoch werden in diesem Messmodus hauptsächlich Detrituspartikel aufgenommen. Der Fluoreszenz-Modus hingegen sollte theoretisch nur fluoreszierende Partikel aufnehmen, um die Anzahl an Detritus zu verringern. Dies ist jedoch nicht der Fall, weil eine Vielzahl an Detrituspartikeln mit fluoreszierenden Partikeln mit gemessen wird. Im Vergleich zu den Zähldaten unter dem Mikroskop unterschätzt die Flow CAM die Abundanz von einzelnen Planktonarten in fast allen Fällen. Dies lässt sich hauptsächlich auf den relativ hohen Schwellenwert des Fluoreszenz-Detektors und auf die variablen Pumpgeschwindigkeiten zurückführen, die verwendet wurden, um die Kontaktraten mit fluoreszierenden Partikeln (Planktern) zu erhöhen. Kapitel IV beschäftigt sich zunächst mit den Auswirkungen von unterschiedlichen Futterqualitäten auf den phagotrophen Flagellaten Oxyrrhis marina. Bis jetzt ist wenig bekannt darüber, inwieweit solch primitiv organisierten Einzeller von unterschiedlichen Futterqualitäten betroffen sind. In mehreren Fraßexperimenten zeigt sich dass dieser Einzeller nicht zwischen unterschiedlichen Futterqualitäten unterscheidet; somit scheint die Futteraufnahme qualitätsunabhängig zu sein. Allerdings wirkt sich Phosphor limitiertes Futter negativ auf die Wachstumsraten von O. marina aus. Stickstoff limitiertes Futter hat dagegen keine negativen Auswirkungen. Der Versuch dies anhand von unterschiedlichen Respirationsraten zu erklären, klappt jedoch nicht, da O. marina in beiden Fällen mehr respiriert, um den überschüssigen Kohlenstoff auszuscheiden. Deshalb scheint Phosphor der begrenzende Faktor zu sein, der schnell wachsende Einzeller limitiert. In wie weit O. marina abhängig von seiner elementaren Ausstattung zwischen Stickstoff und Phosphor limitierendem Futter selektieren kann, wird mit Hilfe der Flow CAM in Kapitel V gezeigt. Die Ergebnisse zeigen jedoch keine Selektion, sondern nur unterschiedliche Aufnahmeraten abhängig davon, was vorher gefressen wurde. Wenn O. marina allerdings das Futter nicht in einer Mischung erhält, sondern einzeln, dann fressen sie signifikant mehr von dem Futter, das sie zuvor nicht bekommen haben. Das bedeutet, das O. marina sowohl den Mangel eines limitierenden Elementes in der eigenen Zelle, aber auch die Nährstoffzusammensetzung des Futters erkennt. Die Tatsache, dass O. marina aber auch weiterhin das Futter frisst, das zuvor schon gefressen wurde, zeigt, dass Zellvorgänge, die die Exkretion überschüssiger bzw. das Zurückhalten limitierender Nährstoffe bestimmen, entscheidender sind als die Selektion zwischen unterschiedlichen Futterqualitäten. Die vorliegende Arbeit soll dazu dienen, um einige wichtige Schwachpunkte der Flow CAM aufzuzeigen. Diese Schwachpunkte gilt es weiter auszuarbeiten, um sicherzustellen, dass die Flow CAM eventuell in Zukunft automatische Zählaufgaben übernehmen kann. Welche Rolle heterotrophe Protisten im marinen Nahrungsnetz spielen können und in wie weit sie von unterschiedlichen Futterqualitäten betroffen sind zeigen die hier durchgeführten Experimente mit dem Modellorganismus O. marina. Weitere Untersuchungen sind notwendig um herauszufinden inwiefern sich diese Ergebnisse auf andere Protisten übertragen lassen.

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Hantzsche, Florian: An evaluation of the effect of food quality on heterotrophic protists with a critical assessment of a new measuring technique (Flow CAM). 2010.

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