Genetic mapping of flowering time genes and functional characterisation of an FVE homologue from sugar beet

Büttner, Bianca

The timing of floral transition is of major importance for the reproductive success of the plant, therefore it is controlled by endogenous and exogenous signals to ensure flowering under favourable conditions. In the model species Arabidopsis thaliana, many floral transition genes have been identified and functionally characterised, and plant genome and EST sequencing projects have started to reveal the presence and evolutionary conservation of these genes across taxa (Albert et al. 2005; Hecht et al. 2005). In the crop species Beta vulgaris in the caryophyllid clade of core eudicots, which is only very distantly related to Arabidopsis, however, the corresponding genes are largely unknown (Müller et al. 2006). Sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) is a biennial crop, which forms a leave rosette and a storage root in the first year and bolts after a period of prolonged cold temperature (vernalization) in the second year (Hohmann et al. 2005). For cultivation of sugar beet bolting in the first year is an undesirable character, because it decreases sugar yield and obstructs the mechanical harvest. On the other side early bolting and flowering are relevant to speed-up breeding and seed multiplication. Annual bolting is believed to be controlled mainly by the bolting locus B (Abegg 1936), which was mapped by RFLP- and high-resolution AFLP-mapping to chromosome II (Boudry et al. 1994; El-Mezawy et al. 2002). The objectives of this project were to transfer, and expand, our knowledge of flowering time control to sugar beet. Bolting and flowering time genes in sugar beet were identified by candidate gene and co-segregation analysis. A revised physical map around the B locus was established by BAC analysis and remapping using five newly developed markers from opposite ends of individual BAC contigs. The new physical map contains two large BAC contigs flanking the B locus on either side. The genetic distance of these contigs to B was estimated as 0.3 cM. The new physical map was the prerequisite for identification of markers completely co-segregating with the bolting locus B and map-based cloning of B. EMS mutagenesis of an annual genotype and phenotypic mutant screening had previously identified several mutants that require vernalization to bolt and thus behave as biennials (Hohmann et al. 2005). There are at least two hypotheses conceivable to explain the mutant phenotypes. 1.) The B gene is mutated ('one-locus model'), and 2.) a second locus is mutated that acts epistatically to B and prevents annual bolting even in the presence of B ('epistatic locus model'). To test the hypothesises F2 populations segregating for the mutant phenotype and molecular markers located at the B locus were generated. In three populations marker genotypes and bolting phenotypes do not co-segregate, suggesting that in these populations annual bolting is effected by a second locus not genetically linked to B. One population was selected for genetic mapping of the second locus, and a genetic map was constructed by AFLP mapping. The novel bolting locus was mapped to chromosome IX and was named B2. Co-segregation analysis with a marker flanking the B2 locus in the remaining F2 populations suggested that B2 is responsible for bolting also in one other population, providing further evidence for the presence of B2 in the beet genome and its functional role in bolting control. In addition a locus controlling bolting independently of B was identified and named B3. In a complementary approach, BvFVE1, a putative orthologue of a flowering time gene of the autonomous pathway, was identified by homology-based methods. In A. thaliana the genes of the autonomous pathway function as floral promoters by repressing the central repressor and vernalization-regulatory gene FLC. Exon-intron and domain structure was found to be conserved between orthologues. BvFVE1 was further functionally characterised by expression profiling in sugar beet and complementation analysis in the Arabidopsis mutant. BvFVE1 was not able to complement the Arabidopsis fve mutant. Complementation analysis of BvFVE1 and the presence of a putative paralogue in beet suggest evolutionary divergence of FVE homologues. It is further shown that BvFVE1, unlike FVE in Arabidopsis, is under circadian clock control. The current study increases our knowledge about bolting and flowering time control in B. vulgaris. The identification and characterisation of BvFVE1 suggests evolutionary diversification in flowering time control between the two distantly related dicot species A. thaliana and B. vulgaris, and the co-segregation analysis was successful in identifying novel bolting factors in B. vulgaris. Future work will show whether the underlying genes have functionally equivalent homologues in Arabidopsis, or have evolved a function specific to Beta. Further, the physical map around the bolting gene B of sugar beet was significantly revised, which was a prerequisite for the subsequent successful cloning of the bolting gene (Müller et al. manuscript in preparation).

Der Zeitpunkt der Blühinduktion ist von überragender Bedeutung für den Vermehrungserfolg von Pflanzen und daher kontrolliert von endogenen und exogenen Signalen, die Blühen unter optimalen Bedingungen sicherstellen (Jung et al. 2007). In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden viele der wichtigen Blühgene identifiziert und funktionell charakterisiert, darüber hinaus zeigen Genom- und EST-Sequenzierungsprojekte das Vorhandensein und die evolutionäre Konservierung dieser Gene in verschiedenen Taxa (Albert et al. 2005; Hecht et al. 2005). In der Art Beta vulgaris, die nur sehr entfernt mit Arabidopsis verwandt ist, sind die entsprechenden Gene weitgehend unbekannt (Müller et al. 2006). Zuckerrübe (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) ist eine zweijährige Art, die im ersten Jahr eine Blattrosette und eine Speicherwurzel bildet und im zweiten Jahr nach anhaltender Kälteeinwirkung (Vernalization) schosst (Hohmann et al. 2005). Für die Kultivierung ist Schossen und Blühen unerwünscht, da es den Ertrag dramatisch reduziert und Probleme bei der Ernte bereitet. Frühes Schossen und Blühen jedoch ist wichtig, um Züchtung und Saatguterzeugung zu beschleunigen. Es wird angenommen, dass Schossen im ersten Jahr hauptsächlich durch das Schossgen B kontrolliert wird (Abegg 1936), das mittels RFLP- und hochauflösender AFLP-Kartierung auf Chromosom II kartiert wurde (Boudry et al. 1994; El-Mezawy et al. 2002). Die Ziele der Arbeit sind das Wissen über Blühzeitkontrolle auf Zuckerrübe zu übertragen und zu erweitern. Blüh- und Schossgene der Zuckerrübe werden mittels Kandidatengen- und Kosegregationsanalyse identifiziert. Eine überarbeitete physikalische Karte um den B-Lokus wurde erstellt, indem einige BACs analysiert und rückkartiert wurden mit der Hilfe von fünf neu entwickelten Markern von den entgegengesetzten Enden der einzelnen BAC-Contigs. Die neue physikalische Karte enthält zwei große BAC-Contigs die den B-Lokus auf beiden Seiten flankieren. Die genetischen Abstände dieser Contigs zu B wurden auf 0,3 cM geschätzt. Die neue physikalische Karte war die Voraussetzung für die Identifizierung eines Markers, der vollständig mit dem Schosslokus B segregiert und die kartengestützte Klonierung von B. EMS-Mutagenese eines einjährigen Genotyps und die anschließende phänotypische Mutantenauswahl identifizierte mehrere Mutanten, die Vernalization brauchen um zu schossen und sich daher wie zweijährige Rüben verhalten (Hohmann et al. 2005). Es gibt mindestens zwei Hypothesen um den Mutantenphänotyp zu erklären: 1.) das Schossgen ist mutiert, und 2.) ein zweites Gen ist mutiert, das epistatisch zu B agiert und schossen im ersten Jahr auch in Anwesenheit von B verhindert. Um die Hypothesen zu überprüfen wurden F2-Populationen erzeugt, die für den Mutantenphänotyp und molekulare Marker am B-Lokus spalten. In drei Populationen spalten Marker und Phänotyp unabhängig voneinander. Diese ist ein Hinweis, dass in diesen Populationen Einjährigkeit von einem zweiten Lokus beeinflusst wird, der nicht mit B gekoppelt ist. Eine Population wurde ausgewählt um den zweiten Lokus genetisch zu kartieren und eine Karte mittels AFLP-Markern erstellt. Der neue Schosslokus wurde auf Chromosome IX kartiert und B2 genannt. Eine Spaltungsanalyse mit B2 flankierenden Markern in einer der verbleibenden Populationen lässt vermuten, dass B2 für das Schossverhalten in einer weiteren Population verantwortlich ist. Dies ist ein weiterer Beweis für das Vorhandensein von B2 im Rübengenom und seine Rolle in der Schossregulation. Darüber hinaus wurde ein Lokus identifiziert, der Schossen unabhängig von B kontrolliert und B3 genannt. In einem ergänzenden Ansatz wurde BvFVE1, ein Ortholog eines Blühgenes des autonomen Weges der Blühregulation anhand von Homologien identifiziert. In A. thaliana sind die Gene des autonomen Weges an der Repression des zentralen Repressors FLC beteiligt und demzufolge induzieren sie das Blühen. Die Exon-Intron und Domain-Struktur ist konserviert zwischen den Orthologen. BvFVE1 wurde weiter funktionell charakterisiert anhand von Expressionsprofilen in Zuckerrübe und Komplementationsanalyse in der Arabidopsis Mutante. BvFVE1 war nicht in der Lage die Mutante zu komplementieren. Diese Analyse und das Vorhandensein eines potentiellen Paralogs in Rübe deuten evolutionäre Divergenz zwischen den FVE Homologen an. Zusätzlich wurde gezeigt, dass BvFVE1 im Gegensatz zu FVE in Arabidopsis circadian reguliert ist. Diese Studie erweitert unser Wissen über Schoss- und Blühkontrolle in B. vulgaris. Die Identifizierung and Charakterisierung von BvFVE1 zeigt evolutionäre Diversifikation in der Blühzeitkontrolle zwischen den beiden entfernt verwandten Arten A. thaliana und B. vulgaris und die Kosegregationsanalyse war erfolgreich in der Identifikation neuer Schossloki in B. vulgaris. Weitere Arbeiten werden zeigen ob die zugrunde liegenden Gene funktionell äquivalente Homologe in Arabidopsis haben oder ob sie eine Funktion spezifisch für Beta entwickelte haben. Desweiteren wurde die existierende physikalische Karte des B-Lokus grundlegend überarbeitet und dies war die Vorraussetzung für die anschließende erfolgreiche kartengestützte Klonierung des Schossgens (Müller et al. Manuskript in Vorbereitung).

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Büttner, Bianca: Genetic mapping of flowering time genes and functional characterisation of an FVE homologue from sugar beet. 2011.

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