Nachweis von Biosynthesegenen des bakteriellenSekundärstoffwechsels sowie Isolierung und Strukturaufklärung von Naturstoffen aus ausgewählten Actinomyceten

Schneemann, Imke

Bakterien und insbesondere Actinobacteria gehören zu den wichtigsten Produzenten von strukturell sehr unterschiedlichen und biologisch aktiven Naturstoffen, welche für die pharmazeutische Anwendung von Relevanz sind. Viele dieser Sekundärmetabolite werden von Bakterien produziert, welche in Assoziation mit einem höheren Organismus leben. Dazu zählen unter anderem manche marine Schwämme, welche häufig eine reichhaltige mikrobielle Gemeinschaft beherbergen. Ziel dieser Arbeit war es, Actinomyceten (im Weiteren als Synonym für die Ordnung Actinomycetales oder die Klasse Actinobacteria benutzt), isoliert aus dem Schwamm Halichondria panicea, sowie ein paar weitere marine und terrestrische Actinomyceten bezüglich ihrer Fähigkeit zur Produktion von Sekundärmetaboliten zu untersuchen, um deren Potential für die Synthese von neuen Naturstoffen näher zu charakterisieren. Für den ersten Teil der Arbeit wurde zunächst eine phylogenetische Einordnung der von H. panicea isolierten Actinomyceten vorgenommen. Die Stämme konnten den Gattungen Actinoalloteichus, Micrococcus, Micromonospora, Nocardiopsis und Streptomyces zugeordnet werden. Anschließend wurden das Sekundärmetabolitprofil, das Vorhandensein von NRPS- und Typ II PKS-Genfragmenten sowie die Bioaktivität der Rohextrakte aller Stämme untersucht. Es zeigte sich, dass die Schwamm-assoziierten Actinomyceten, und gerade jene mit einem NRPS- oder PKS-Genfragment, ergiebige Produzenten von biologisch aktiven Naturstoffen waren. Im Anschluss daran wurden drei der untersuchten Stämme einer Reihe von Kultivierungs- bzw. Stimulierungsexperimenten unterzogen, um so ihr chemisches Profil noch näher zu untersuchen. Zwei dieser Actinomyceten, Streptomyces sp. HB202 und Nocardiopsis sp. HB383, waren durch Variation der Kultivierungsbedingungen besonders beeinflussbar und besaßen ein enorm großes Potential zur Synthese von Substanzen. Mittels HPLC-UV/MS und NMR-Spektroskopie wurde das aromatische Polyketid Mayamycin aus Streptomyces sp. HB202 sowie die γ-Pyrone Nocapyron A - D aus Nocardiopsis sp. HB383 isoliert und aufgeklärt. Die biologische Aktivität dieser Substanzen wurde ermittelt und die Biosynthese des Nocapyron A mithilfe von Fütterungsexperimenten untersucht. Ferner wurden die bereits erprobten molekularbiologischen Untersuchungsmethoden auf das Vorhandensein von NRPS- und Typ II PKS-Genfragmenten durch ein zusätzliches Primersystem zur Amplifizierung von Phenazingenfragmenten erweitert werden. Die Relevanz dieser genetischen Informationen wurde durch Kultivierung und chemische Analyse von ausgewählten, phylogenetisch diversen Stämmen überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass das etablierte molekularbiologische System besonders gut bei marinen Actinomyceten funktionierte. Außerdem wurde das gesamte Spektrum der in dieser Arbeit erprobten Methoden bei der Untersuchung von Nocardia jejuensis DSM 44959T angewendet. Durch ein zusätzliches Klonierungsexperiment konnten NRPS sowie Typ II PKS-Genfragmente identifiziert werden. In anschließenden Kultivierungsversuchen wurden neben bekannten Substanzen zwei neue Mycobactine, Brasilibactin C und D, produziert. Die Analyse der biologischen Aktivität zeigte, dass Brasilibactin C antibakteriell sowie zytotoxisch aktiv war.

Bacteria, especially Actinobacteria, are one of the most important producers of structurally diverse and biologically active natural products, which are of great significance for pharmaceutical applications. Many secondary metabolites are synthesized by bacteria living in association with a macroorganism. Among others, marine sponges shelter a rich community of microorganisms. Actinomycetes (in the following used as synonym for the order Actinomycetales or the class Actinobacteria) isolated from the marine sponge Halichondria panicea as well as other marine and terrestrial Actinomycetes were investigated according to their ability to produce well-established and unknown secondary metabolites to characterize bacterial capability of producing natural products. A phylogenetic classification of Actinomycetes isolated from H. panicea was completed within the first part of this thesis. Strains were assigned to the genera Actinoalloteichus, Micrococcus, Micromonospora, Nocardiopsis and Streptomyces. Subsequently, the secondary metabolite pattern, the presence of NRPS and type II PKS gene fragments as well as the biological activity of raw extracts of all strains were investigated. In conclusion, sponge associated Actinomycetes and particularly those with an NRPS or PKS gene fragment, were effective producers of biologically active natural products. Subsequently, with three of the investigated strains, cultivation and stimulation experiments were carried out to provide detailed chemical profiles. Two of these, Streptomyces sp. HB202 and Nocardiopsis sp. HB383, were notably affected by different culture conditions and showed an enormous potential to produce known as well as novel substances. Using HPLC-UV/MS and NMR-spectroscopy, mayamycin, an aromatic polyketide, of Streptomyces sp. HB202, and four new γ-pyrones, of Nocardiopsis sp. HB383, nocapyrones A-D, were isolated and structually characterized. Their biological activity was determined and the biosynthesis of nocapyrone A was investigated by feeding experiments. In the second part of this thesis, the genetic analysis regarding the presence of NRPS and type II PKS gene fragments was extended by an additional primer system amplifying a phenazine gene fragment. The relevance of the genetic information was validated by cultivation experiments and chemical analysis of selected, phylogenetically diverse, strains. As a result, marine Actinomycetes seem to be ideal for investigations using the designed molecular biological system The wide range of proven methods was applied by investigating Nocardia jejuensis DSM 44959T. Using further cloning experiments, NRPS and type II PKS gene fragments were identified. Subsequent cultivation approaches reveal among known metabolites two novel mycobactines, brasilibactin C and D. After the structural characterization of the investigated products, biological activities of the metabolites were tested.

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Schneemann, Imke: Nachweis von Biosynthesegenen des bakteriellenSekundärstoffwechsels sowie Isolierung und Strukturaufklärung von Naturstoffen aus ausgewählten Actinomyceten. 2011.

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