Investigating the functional importance of biased codon usage within the bacterial species Pseudomonas fluorescens

Mukherjee, Anuradha ORCID

The genetic code is degenerate – 20 proteinogenic amino acids are coded for by 61 functional codons. One might then expect all the codons for an amino acid, called synonymous codons, to be used equally. However, across all domains of life, preferential use of synonymous codons has been observed. This phenomenon is called codon bias. Synonymous substitutions, nucleotide level changes that do not modify the amino acid sequence, were widely viewed to be selectively neutral. Mounting evidence, however, indicates otherwise – synonymous substitutions can induce non-neutral and measurable fitness effects. Experimental studies with randomised codon usage in genes from both prokaryotes and eukaryotes reveal large-scale fitness effects, ranging from altered growth, global changes in both transcription and translation and protein output and function. The effects of synonymous substitutions become particularly prominent in bacteria, where growth rate is often limited by the speed of translation. However, these observations mainly arise from selectively enriching certain codons, a pattern that is rare in naturally evolved genomes. To investigate the functional implications of naturally diverged patterns of codon usage we have identified an essential and highly expressed gene that exclusively exhibits synonymous differences across three genomes of Pseudomonas fluorescens bacteria. These variants were swapped between genomes to test for effects on gene expression and fitness. To swap the synonymous alleles between genomes, I have optimised a scar-free genetic engineering technique that is routinely used for SBW25, to A506 and Pf0-1. The resulting mutants varied from the corresponding wild type strains at only one locus – the locus of the gene that was swapped. I proceeded to test for the effects synonymous substitutions on gene expression and fitness and demonstrated that changing established codon usage patterns of a gene in one strain to that of another strain has considerable effects on gene expression (transcription). Having optimised a technique for manipulating genomes of P. fluorescens strains (besides SBW25), I proceeded to examine the genetic basis of one of the most studied and extensively characterised phenotype of P. fluorescens – the ability to form mats at the air-liquid interface. First, I compared mat formation phenotype in A506, Pf0-1 and PICF7 to the model strain SBW25; while, SBW25, A506 and PICF7 formed mats, Pf0-1 did not. To identify the genetic routes to mat formation in PICF7, I developed tools for transposon suppressor analysis, which revealed that unlike SBW25, which utilises the cellulose biosynthetic machinery encoded by the wss genes to form mats, PICF7 makes use of the pel operon to synthesise the Pel exopolysaccharide. Pel is an exopolymer known to form biofilms (mats) in P. aeruginosa. Using genetic engineering techniques I identified that A506 does not use wss genes either, but the pga operon to produce mats, a pathway seldom utilised in SBW25. The lack of mat forming ability in liquid medium by Pf0-1 is intriguing as it possesses some of the structural genes known from P. aeruginosa and is reported to form mats on solid surfaces. While different structural genes are exploited by the three mat forming strains (SBW25, A506 and PICF7), the central regulatory pathways that fine-tune the expression of the operons have remained the same. This is suggestive of a modular mechanism, wherein multiple structural genes can substitute for one another across genomes. So far, our understanding of P. fluorescens genome evolution has been limited to SBW25. With the development of genetic tools within the scope of this thesis, we now have the opportunity to expand on the comparative study of P. fluorescens and the efficacy of these tools for the same has been amply demonstrated through the examination of the effects of changing naturally evolved synonymous codons as well as the variation in molecular routes exploited to colonise the air-liquid interface.

Der genetische Code ist degeneriert – das heisst die 20 proteinogenen Aminosäuren werden von 61 funktionellen Codons codiert. Man könnte daher erwarten, dass alle Codons für eine Aminosäure, auch synonyme Codons genannt, gleichermaßen verwendet werden. Es wird jedoch in allen biologischen Domänen die bevorzugte Verwendung von bestimmten synonymen Codons beobachtet. Dieses Phänomen nennt man verzerrte Codonverwendung oder codon bias. Solche synonymen Substitutionen, also Veränderungen des Nukleotidspiegels, die die Aminosäuresequenz nicht verändern, wurden weithin als selektiv neutral angesehen. Eine wachsende Zahl an Studien deuten jedoch auf etwas anderes hin - auch Substitutionen können nicht-neutrale und messbare Fitnesseffekte hervorrufen. Experimentelle Studien mit randomisierter Codonverwendung in Genen von Prokaryonten und Eukaryonten zeigen große Fitnesseffekte, die von verändertem Wachstum über globale Veränderungen der Transkription und Translation bis hin zu unterschiedlicher Proteinproduktion und -funktion reichen. Die Auswirkungen synonymer Substitutionen treten besonders bei Bakterien auf, bei denen die Wachstumsrate häufig durch die Geschwindigkeit der Translation begrenzt wird. Diese Beobachtungen ergeben sich jedoch hauptsächlich aus der selektiven Anreicherung bestimmter Codons, ein Muster, das in natürlich entwickelten Genomen selten vorkommt. Um die funktionellen Implikationen von natürlich divergierenden Mustern der Codonverwendung zu untersuchen, haben wir ein essentielles und hoch exprimiertes Gen identifiziert, das ausschließlich synonyme Unterschiede zwischen drei Genomen des Bakteriums Pseudomonas fluorescens aufweist. Diese Varianten wurden zwischen diesen Genomen ausgetauscht, um die Auswirkungen auf die Genexpression und Fitness zu testen. Um die synonymen Allele zwischen den Genomen auszutauschen, habe ich eine narbenfreie Gentechnik optimiert, die routinemäßig für Pseudomonas fluorescens SBW25, A506 und Pf0-1 angewendet wird. Die resultierenden Mutanten unterschieden sich von den entsprechenden Wildtyp-Stämmen nur an einem Ort - dem Ort des Gens, das ausgetauscht wurde. Ich habe dann die Auswirkungen von Synonym-Substitutionen auf die Genexpression und Fitness getestet und konnte zeigen, dass der Austausch der etablierten Codon-Verwendungsmuster eines Gens von einem Stamm zu einem anderen erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression (Transkription) hat. Nachdem ich eine Technik zur Manipulation des Genoms von P. fluorescens-Stämmen (zusätzlich zu SBW25) optimiert hatte, untersuchte ich die genetische Basis eines der am besten untersuchten und am ausführlichsten charakterisierten Phänotypen von P. fluorescens - die Fähigkeit, Matten an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu bilden . Zunächst verglich ich den Phänotyp der Mattenbildung in A506, Pf0-1 und PICF7 mit dem Modellstamm SBW25; während SBW25, A506 und PICF7 Matten bildeten, tat Pf0-1 dies nicht. Um die genetischen Wege zur Mattenbildung in PICF7 zu identifizieren, entwickelte ich Werkzeuge für die Transposon-Suppressor-Analyse. Diese zeigten, dass PICF7 im Gegensatz zu SBW25, bei dem die von den wss-Genen kodierten Zellulosebiosynthesemaschinen zur Bildung von Matten verwendet werden, das Pel-Operon zur Synthese des Pel-Exopolysaccharids verwendet. Pel ist ein Exopolymer, von dem bekannt ist, dass es Biofilme (Matten) in P. aeruginosa bildet. Unter Verwendung genetischer Techniken stellte ich fest, dass A506 auch keine wss-Gene verwendet um Matten herzustellen, sondern das pga-Operon, welches in SBW25 selten dazu genutzt wird. Das Fehlen der Fähigkeit zur Mattenbildung in flüssigem Medium durch Pf0-1 ist faszinierend, da es einige der von P. aeruginosa bekannten Strukturgene besitzt und Berichten zufolge auf festen Oberflächen Matten bildet. Während die drei mattenbildenden Stämme (SBW25, A506 und PICF7) unterschiedliche Strukturgene ausnutzen, sind die zentralen Regulationswege, welche die Expression der jeweiligen Operons optimieren, gleich geblieben. Dies lässt auf einen modularen Mechanismus schließen, bei dem mehrere Strukturgene sich über die Genome hinweg gegenseitig ersetzen können. Bisher beschränkte sich unser Verständnis der Genomentwicklung von P. fluorescens auf den Stamm SBW25. Mit der Entwicklung genetischer Werkzeuge im Rahmen dieser Arbeit haben wir nun die Möglichkeit, die vergleichenden Studien von P. fluorescens zu erweitern. Die Wirksamkeit dieser Werkzeuge wurde durch die Untersuchung natürlicher Veränderungen synonymer Codons sowie die Variation der molekularen Wege, die zur Besiedlung der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche genutzt werden, ausführlich demonstriert.

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Mukherjee, Anuradha: Investigating the functional importance of biased codon usage within the bacterial species Pseudomonas fluorescens. 2020.

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