Die Sialat-Pyruvat-Lyase aus Clostridium perfringens A99 : Isolierung des rekombinanten Enzyms und Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus

Krüger, Dorothea

Die Sialat-Pyruvat-Lyase (EC 4.1.3.3) katalysiert die Spaltung von Sialinsäuren in Pyruvat und das entsprechende Mannosamin. Die Sialat-Pyruvat-Lyase von Clostridium perfringens wurde in E. coli exprimiert, bis zur Homogenität gereinigt und charakterisiert. Das rekombinante Enzym besitzt ein pH-Optimum von 7,6 und ein Temperaturoptimum von 65-70 °C. In Gegenwart von Pyruvat ist es moderat thermostabil bis etwa 70 °C. Das Enzym besitzt in 50 mM Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,2 eine spezifische Aktivität von 22 U/mg und einen KM-Wert für Neu5Ac von 2,1 mM. Beide Werte erhöhen sich in 250 mM Kaliumphosphatpuffer auf dann 27 U/mg und 3,2 mM. Steigende Salzkonzentrationen hemmen dagegen die Enzymaktivität. Durch zielgerichtete Mutagenese konnte gezeigt werden, dass Lysin 161 während der Katalyse eine Schiff'sche Base mit dem Substrat ausbildet. Tyrosin 133 hat ebenfalls große Bedeutung für die Enzymkatalyse, die genaue Funktion von Tyrosin 133 ist allerdings unklar. Vermutlich stabilisiert dieser Tyrosinrest die Seitenkette von Lysin 161 und/oder das gebundene Substrat und ermöglicht dadurch eine optimale Katalyse. Aspartat 187 und Glutamat 188 sind an der Bindung des Substrates im aktiven Zentrum beteiligt. Sie bilden Wasserstoffbrückenbindungen zu den Hydroxylgruppen an C8 und C9 der Sialinsäure aus. Anhand der Ergebnisse aus den Mutagenesestudien wurde das Modell zum Reaktionsmechanismus der Sialat-Pyruvat-Lyasen modifiziert.

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Krüger, Dorothea: Die Sialat-Pyruvat-Lyase aus Clostridium perfringens A99. Isolierung des rekombinanten Enzyms und Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus. 2000.

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