Untersuchungen zur Interaktion von Staphylococcus aureus mit Thrombozyten und Endothelzellen

Niemann, Silke

Staphylococcus aureus ist ein wichtiger Krankheitserreger bei intravaskulären Infektionen wie der infektiösen Endokarditis. In der Pathogenese endovaskulärer Infektionen ist die Anbindung an das Wirtsgewebe der erste wichtige Schritt. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Aufklärung des Adhäsionsmechanismus von Staphylococcus aureus an Thrombozyten und Endothelzellen durchgeführt. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei sowohl auf die Identifizierung der für die Interaktion relevanten Rezeptoren auf der bakteriellen Seite, als auch auf die Untersuchung von Plasmaproteinen als Brückenmoleküle gelegt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die vier plasmatischen Adhäsionsproteine Fibrinogen, TSP-1, vWF und Fibronektin in der flüssigen Phase konzentrationsabhängig an S. aureus binden und dass diese Bindung auch nahezu oder vollständig eine Sättigung erreicht. Die Adhäsionsproteine können dabei miteinander konkurrieren. Die Untersuchungen zur Bindung von S. aureus an Plättchen zeigten, dass nicht Fibrinogen, sondern Fibrin der Vermittler der S. aureus-Thrombozyten-Assoziation ist. Auch TSP-1 und Fibronektin haben einen Assoziat-fördernden Einfluss. Die Bakterien banden dabei vornehmlich an aktivierte Plättchen. Es konnte ein hypothetisches Modell entwickelt werden, in dem Fibrin, TSP-1 und Fibronektin auf der Oberfläche der aktivierten Plättchen große Bindungs-Cluster bilden, die eine starke Bindung von S. aureus an Thrombozyten ermöglichen. Auch für die durch S. aureus ausgelöste Plättchenaggregation ist die Bildung von löslichem Fibrin ein Schlüsselmechanismus. Die Assoziat-vermittelnde Rolle von Fibrin und die Notwendigkeit der Plättchenaktivierung ist nicht nur auf S. aureus beschränkt, sondern konnte auch für die Assoziation von unbekapselten oder leicht bekapselten Streptococcus pneumoniae-Stämmen mit Thrombozyten gezeigt werden Nachdem die Bedeutung der Plasmaproteine als Brückenmoleküle herausgestellt wurde, galt in dieser Arbeit den Adhäsinen auf S. aureus, die Plasmaproteine binden können, ein großes Interesse. Für die Interaktion von S. aureus mit dem Wirtsgewebe ist bekannt, dass der MSCRAMM-Familie der Staphylokokken-Oberflächen-Proteine eine wichtige Bedeutung zukommt. Es sind Proteine mit einem homologen Aufbau, die adhäsive Matrixmoleküle wie Kollagen, Fibrinogen oder TSP-1 binden. Die wichtigsten MSCRAMMs sind Protein A, ClfA, ClfB, FnBPA und FnBPB. Bindungsversuche mit löslichen Adhäsionsproteinen (Fibrinogen, TSP-1, vWF und Fibronektin) an S. aureus MSCRAMM-Deletionsmutanten bzw. an fnbA und fnbB expremierende Staphylococcus carnosus Stämme zeigten, dass die untersuchten MSCRAMMs promiskuitiv sind: ein MSCRAMM konnte mehrere Adhäsionsproteine binden und ein Adhäsionsprotein an mehrere MSCRAMMs. In der Eigenschaft der Promiskuität sind die MSCRAMMs den Integrinen der Eukaryonten ähnlich. Mit Hilfe von ClfA-Deletionsmutanten und fnbA und fnbB exprimierenden S. carnosus Stämmen konnte auch gezeigt werden, dass ClfA, FnBPA und FnBPB in die S. aureus-Thrombozyten-Assoziation involviert sind. In der Plasmamembran von Plättchen kommen Syndecane vor. Dies sind Transmembranproteine, deren Heparansulfat-Ketten Interaktionen mit verschiedenen extrazellulären Matrixproteinen, so auch TSP-1, ermöglichen. Im Rahmen dieser Dissertation konnte mit Hilfe von Syndecan-1- und Syndecan-4-knock-out Mäusen gezeigt werden, dass Syndecane die S. aureus-Plättchen-Assoziation vermitteln. S. aureus kann nicht nur an Plättchen anbinden, sondern diese auch aktivieren. Es wurde in dieser Arbeit der Vermutung nachgegangen, dass Staphylokinase mit Staphylokinase-Antikörpern einen Komplex bildet, der an den FcRIIa-Rezeptor bindet und dadurch die Plättchen aktiviert. Es konnte dazu gezeigt werden, dass sich Kaninchenplättchen nach Immunisierung mit Staphylokinase durch S. aureus besser aktivieren ließen als vor der Antikörperbildung. Als letzter Teil der Arbeit wurde die S. aureus-Endothelinteraktion untersucht. S. aureus kann besser in endovaskuläres Gewebe einwandern als andere Bakterienarten. Um einen Einblick in den Mechanismus der S. aureus-Endothelinteraktion zu erlangen, wurde der Einfluss von Fibrinogen, Fibrin, TSP-1 und Plättchen auf die Anbindung von S. aureus an und die Invasion in Endothelzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TSP-1 die Adhärenz von S. aureus an Endothelzellen steigert, ebenso steigern Plättchen zusammen mit Fibrinogen oder Fibrin die Adhärenz. Plättchen zusammen mit Fibrin steigerten auch die Invasion von S. aureus in Endothelzellen.

Staphylococcus aureus is a highly virulent pathogen and a frequent cause of endovascular infections, such as infective endocarditis. Microbial adhesion to host tissue is the initial critical event in the establishment of bacterial infections. In this dissertation the mechanisms underlying the adhesion of S. aureus to platelets and to endothelial cells were examined. Special attention was focused on the identification of receptors on S. aureus that are important for the interaction and on the examination of plasma proteins acting as bridging molecules. It was shown in this study that the four adhesion proteins fibrinogen, TSP-1, vWF and fibronectin bound to S. aureus in solution in a concentration dependent manner and that this binding was almost or completely saturable. The adhesion proteins can compete against each other for the binding. Studies to examine the binding of S. aureus to platelets showed that not fibrinogen, but soluble fibrin is the main mediator of platelet-S. aureus-association. TSP-1 and fibronectin enhanced the associate formation as well. Bacteria primarily bound to activated platelets. A hypothetical model was developed in which fibrin, TSP-1 and fibronectin form large binding clusters at the surface of activated platelets to promote strong adhesion of S. aureus. Formation of soluble fibrin is the key mechanism for platelet aggregation induced by S. aureus as well. The associate-mediating function of fibrin and the necessity of platelet activation is not limited to S. aureus, but was also shown for Streptococcus pneumoniae-platelet-association. Having exposed the importance of plasma proteins as bridging molecules, the interest was directed towards the plasma protein binding adhesins of S. aureus. In the interaction of S. aureus with host tissue, it is known that the MSCRAMM-family of staphylococcal surface proteins is of major importance. These proteins have a homologous structure and bind adhesive matrix molecules like collagen, fibrinogen or TSP-1. The major MSCRAMMs are protein A, ClfA, ClfB, FnBPA and FnBPB. Using S. aureus MSCRAMM mutants and complemented mutants as well as S. carnosus that heterologously expressed fnbA or fnbB, it was shown that the studied MSCRAMMs are promiscuous. All of them bound fibrinogen, TSP-1, vWF and fibronectin. In this respect, the major MSCRAMMs resemble integrins of eucaryotic cells, as one integrin can bind several different ligands and one particular ligand may be recognized by several integrins. By using ClfA deficient S. aureus mutants and S. carnosus strains expressing fnbA or fnbB it was also shown that ClfA, FnBPA and FnBPB are involved in S. aureus-platelet-association. Syndecans are found in the plasma membrane of platelets. They are transmembrane proteins and their heparan sulfate chains allow for interaction with different extracellular matrix proteins, among them TSP-1. Using syndecan-1 and syndecan-4 knock out mice, it was shown that syndecans mediate binding of S. aureus to platelets. S. aureus is not only able to bind to platelets, but is also able to activate them. In this study it was checked on the assumption that staphylokinase forms a complex with stapylokinase-antibodies which bind to the FcRIIa-receptor and thereby activates the platelets. It was shown that rabbit platelets became activated by S. aureus easier after immunization than before antibody generation. In the last part of this thesis the S. aureus-endothelial cell-interaction was studied. S. aureus is known to colonise and invade endovascular tissue better than other bacterial species. To get an insight into the mechanisms underlying the processes of S. aureus-endothelial cell interaction, the influence of fibrinogen, fibrin, TSP-1 and platelets on the interaction was studied. It was shown that TSP-1 as well as platelets combined with fibrinogen or fibrin enhances the adherence of S. aureus to endothelial cells. Moreover, platelets in combination with fibrin enhanced the invasion of endothelial cells.

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Niemann, Silke: Untersuchungen zur Interaktion von Staphylococcus aureus mit Thrombozyten und Endothelzellen. 2007.

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