Apoptosis is a natural stimulus of IL-6R shedding and contributes to the proinflammatory trans-signalling function of neutrophils

Chalaris, Athena

Interleukin-6 (IL-6) trans-signalling has emerged as a prominent regulator of immune responses during both innate and acquired immunity. Regulation of IL-6 trans-signalling is reliant upon the release of soluble IL-6R (sIL-6R), which binds IL-6 to create an agonistic IL-6/sIL-6R complex capable of activating cell types that would normally not respond to IL-6 alone. Soluble IL-6R is generated by proteolytic cleavage of the membrane-anchored precursor (shedding) or from alternative spliced mRNA. Several inducers of IL-6R shedding such as bacterial pore forming toxins, bacterial metalloproteases, the phorbol ester PMA, cholesterol depleting agents and C-reactive protein have been identified in previous studies. IL-6R shedding induced by PMA and cholesterol depletion is dependent on the metalloprotease ADAM17 (A Disintegrin And Metalloprotease), and to a lesser extent on the related sheddase ADAM10. In this study apoptosis was identified as a natural stimulus of IL-6R shedding. Apoptosis, or programmed cell death, plays an important role in regulating growth, tissue homeostasis, development and immune responses. The induction of apoptosis is mediated by extrinsic and intrinsic pathways which require the cooperation of a series of molecules including signal molecules and receptors, enzymes and gene regulating proteins. Among them, the caspase-cascade signalling system is crucial for induction, transduction and amplification of intracellular apoptotic signals. This study demonstrates that intrinsic and extrinsic apoptotic stimulation of cells by DNA-damage, cytokine deprivation, UV irradiation and Fas ligation promotes shedding of the IL-6R from the cell surface thereby generating sIL-6R. Apoptosis-induced shedding of the IL-6R was caspase dependent but PKC, MAPK and ROS independent. Inhibition of ADAM17 during apoptosis by small pharmacological inhibitors or a dominant-negative ADAM17 variant resulted in prevention of IL-6R shedding. The sIL-6R generated during apoptosis was biological active and formed complexes with IL-6 thereby facilitating IL-6 trans-signalling in nonapoptotic cells. Neutrophils have a short life span and die rapidly via apoptosis in vivo and in vitro. In this study neutrophils were used as a cellular model. Induction of apoptosis by Fas-ligation or UV irradiation of primary human neutrophils promoted IL-6R shedding thereby resulting in a two-fold increase of sIL-6R release. Neutrophils represent the first cell population infiltrating inflamed areas and play a crucial role during inflammatory responses due to their extraordinary microbial capacity. Following phagocytosis of invaded microorganisms neutrophils undergo apoptosis as a mechanism to promote resolution of inflammation. The second cell population which migrates into the inflamed area consists mostly of mononuclear phagocytes (monocytes) which are responsible for the clearance of apoptotic neutrophils thus leading to resolution of the inflammatory reaction. Findings in this study indicate that apoptosis-induced shedding of the IL-6R from the neutrophils surface facilitates formation of an [IL-6/sIL-6R] complex which directs IL-6 trans-signalling presumably on endothelial cells to promote recruitment of mononuclear phagocytic cells involved in the nonphlogisic removal of apoptotic neutrophils. Using a mouse model of acute inflammation, it was demonstrated in this study that blocking IL-6R-mediated signal transduction by neutralizing antibodies or soluble gp130-Fc during acute inflammation resulted in a normal influx of neutrophils but a severely impaired influx of monocytes into the inflamed area. Therefore, IL-6R shedding and subsequent IL-6 trans-signalling represent important steps for the resolution of inflammatory responses by controlling the recruitment of mononuclear phagocytes. Thus, shedding of the IL-6R during neutrophil apoptosis may have profound effects on the outcome of the inflammatory response.

Interleukin-6 (IL-6) vermitteltes Trans-signalling ist ein wichtiger regulatorischer Signalweg für die Steuerung der angeborenen und erworbenen Immunität. IL-6 Trans-signalling wird durch die Freisetzung vom löslichen Interleukin-6-Rezeptor (sIL-6R) moduliert; dieser bindet an IL-6, um einen IL-6/sIL-6R Komplex zu bilden. Der Komplex aus IL-6 und sIL-6R kann dann Zellen stimulieren, die lediglich gp130 exprimieren und normallerweise nicht in der Lage sind auf IL-6 zu reagieren, da ihnen die ligandenbindende Untereinheit (IL-6R) fehlt. Die lösliche Form des IL-6Rs kann entweder durch limitierte Proteolyse des membranständigen Rezeptors oder durch alternatives Spleißen der IL-6R mRNA generiert werden. In vorherigen Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass die limitierte Proteolyse des IL-6Rs (Shedding) durch bakterielle porenformende Toxine, bakterielle Metalloproteasen, den Phorbolester PMA, Cholesterinentzug und C-reaktivem Protein induziert werden kann. Shedding des IL-6Rs durch Phorbolester und Cholesterinentzug wird hauptsächlich durch die Metalloprotease ADAM17 (A Disintegrin And Metalloprotease 17) und zum geringen Teil von der verwandten Protease ADAM10 vermittelt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass apoptotische Zellen vermehrt den IL-6R spalten; demnach stellen apoptotische Prozesse einen physiologischen Stimulus für induzierte IL-6R Proteolyse dar. Apoptose wird auch als programmierter Zelltod bezeichnet und spielt in der Regulation von Zellwachstum, Gewebehomöostase und Immunreaktionen eine entscheidende Rolle. Apoptose kann abhängig von der Art des auslösenden Reizes auf verschiedene Wege eingeleitet werden; zum einen durch Aktivierung von Todesrezeptoren auf der Zellmembran und zum anderen durch mitochondrial vermittelte Signalwege. Hauptmerkmal beider Apoptosewege sind Caspasen (Cysteinproteasen), welche die morphologischen und biochemischen Merkmale der Apoptose durch Spaltung von zellulären Bestandteilen hervorrufen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl todesrezeptoren- als auch mitochondrialvermittelte Apoptose zu vermehrter Proteolyse des IL-6Rs führt. Dabei wurde zelluläre Apoptose durch verschiedene Wege induziert, wie zum Beispiel durch toxische Substanzen, die zur Schädigung des genetischen Materials führen, UV-Bestrahlung, Aktivierung des Todesrezeptors CD95 (Fas) oder Entzug von Überlebensfaktoren. Das durch Apoptose induzierte IL-6R Shedding war Caspase-abhängig jedoch PKC-, MAPK- und ROS- unabhängig. Des Weiteren führte eine Inhibition von ADAM17 durch kleine pharmakologische Inhibitoren oder durch eine dominant-negative ADAM17 Variante während des programmierten Zelltodes zur kompletten Unterbindung von apoptosevermitteltem IL-6R Shedding. Der lösliche IL-6R, welcher während der Apoptose vermehrt gebildet wurde, war biologisch aktiv und konnte im Komplex mit IL-6 in nicht-apoptotischen gp130 exprimierenden Zellen Trans-signalling auslösen. Polymorphkernige Neutrophile sind kurzlebige Zellen mit einer Lebensdauer von 6-8 Stunden; danach sterben Neutrophile durch Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Neutrophile als zelluläres System verwendet. CD95 (Fas) Aktivierung und UV-Bestrahlung lösten in primären humanen Neutrophilen Apoptose aus, welche mit erhöhtem Shedding des IL-6Rs einherging. Bei Entzündungsprozessen stellen Neutrophile die erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen dar. Neutrophile phagozytieren Mikroorganismen und töten diese durch vermehrte Produktion von Sauerstoffradikalen ab. Um die inflammatorische Reaktion zu beenden, müssen die aktivierten Neutrophilen eliminiert werden. Dies passiert durch die Einleitung von Apoptose in aktivierten Neutrophilen und anschließender Phagocytose durch mononukleäre Immunzellen (Monocyten), welche als zweite Zellpopulation in den Entzündungsort einwandern. Ergebnisse in dieser Arbeit zeigen, dass apoptotische Neutrophile verstärkt den IL-6R spalten. Dieser bildet einen Komplex mit IL-6. Der Komplex aus sIL-6R/IL-6 stimuliert daraufhin endotheliale Zellen, Mediatoren auszuschütten, die an der Rekrutierung von Monocyten beteiligt sind. Mit Hilfe eines murinen Krankheitsmodelles (Air-pouch-Modell) konnte gezeigt werden, dass Blockierung von sIL-6R-vermittelten Signalwegen durch neutralisierende Antikörper oder rekombinantem löslichen gp130-Fc zu einer stark verminderten Akkumulation von Monocyten in den Entzündungsherd führt. Demnach wird der sIL-6R von apoptotischen Neutrophilen freigesetzt und beeinflusst bei entzündlichen Prozessen die Einwanderung von Monocyten, welche für das Beenden der inflammatorischen Reaktion verantwortlich sind.

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Chalaris, Athena: Apoptosis is a natural stimulus of IL-6R shedding and contributes to the proinflammatory trans-signalling function of neutrophils. 2007.

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