Charakterisierung des Rho GDI Rdi1 in Saccharomyces cerevisiae

Tiedje, Christopher

Rho GTPasen besitzen in allen Organismen eine herausragende Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung von Zellpolarität. Sie werden u.a. von Rho GDIs (Rho Guaninnukleotid- Dissoziationsinhibitor) reguliert, welche die Fähigkeit besitzen, den hydrophoben Membrananker von Rho GTPasen zu binden. Dadurch können sie Rho Proteine von Membranen extrahieren. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird mit Rdi1 ein einziger, für Rho GTPasen spezifischer GDI exprimiert. Das Ziel der Arbeit war die umfassende Charakterisierung von Rdi1 und die Analyse neuer Regulationsmechanismen an denen Rdi1 beteiligt ist. Es zeigte sich zunächst, dass Rdi1 spezifisch an Cdc42, Rho1 und Rho4 binden konnte und diese Rho GTPasen von Membranen extrahierte. Die anderen drei Rho GTPasen Rho2, Rho3 und Rho5 interagierten nicht mit Rdi1. Es wurde deutlich, dass die Bindung von Rdi1 an Cdc42 und Rho1 von der PAK (p21-aktivierten Kinase) Cla4 abhängig war. Da Cla4 ein direktes Effektormolekül von Cdc42 ist, handelte es sich wahrscheinlich um einen positiven Rückkopplungsprozess, der die Rdi1-Cdc42/Rho1 Komplexe reguliert. Für die Regulation von Rho4 konnte ein neuer Mechanismus identifiziert werden. Die Extraktion von Rho4 durch Rdi1 führte hierbei zum selektiven Abbau des Rho Proteins durch das Proteasom und die Vakuole. Der Abbauprozess hing zusätzlich von der GSK-3β Glykogen-Synthase-Kinase Ygk3 ab. Durch Fluoreszenzmikroskopieexperimente wurde deutlich, dass Rho4, wie Cdc42 und Rho1, an Orten polarisierten Wachstums lokalisierte. Dies beinhaltete beispielsweise die Knospenhalsregion und den Ort des zukünftigen Knospenwachstums. Ausgenommen war jedoch die Spitze der Paarungsprojektion. In weiteren Studien wurde unter Zuhilfenahme von verschiedenen Screening-Techniken das Hefegenom hinsichtlich neuer Interaktoren von Rdi1 analysiert. In einem Split-Ubiquitin-Screen konnte, neben verschiedenen anderen putativen Interaktoren, die Exocystkomponente Sec6 als ein mutmaßlicher Interaktor von Rdi1 identifiziert werden. Die Interaktion von Rdi1 mit Sec6 konnte in einem in vitro Bindungsexperiment bestätigt werden. Unabhängig von der Charakterisierung des Rho GDI Rdi1, sollten die in einem Split-Ubiquitin-Screen identifizierten potentiellen Interaktionen der PAK Ste20 mit Proteinen, die eine Rolle bei der Ergosterolsynthese in S. cerevisiae spielen, in in vitro Bindungsexperimenten bestätigt werden. Dabei konnten die Interaktionen von rekombinantem Ste20 mit Erg4 und Cbr1 dargestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen der Regulation von Rho GTPasen und allgemeinen Zellpolaritätsprozessen bei.

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Tiedje, Christopher: Charakterisierung des Rho GDI Rdi1 in Saccharomyces cerevisiae. 2008.

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