Charakterisierung der für die Reifung der Hydrogenase und anderer Metall-Enzyme von Synechocystis sp. PCC 6803 zuständigen Gene

Hoffmann, Dörte

In der vorliegenden Arbeit wurde die Reifung der bidirektionalen [NiFe]-Hydrogenase durch Deletionsmutanten der akzessorischen Gene von Synechocystis sp. PCC 6803 untersucht. Hydrogenaseaktivitätsmessungen der Deletions- und Insertionsmutanten von hypA1 (slr1675), hypA2 (sll1078), hypB1 (sll1432), hypB2 (sll1079), hypC (ssl3580), hypD (slr1498), hypE (sll1462), hypF (sll0322) und hoxW (slr1876) haben gezeigt, dass alle diese für die Hyp-Proteine kodierenden Gene, bis auf hypA2- und hypB2, essentiell für die Prozessierung der Hydrogenase sind. Komplementationsmutanten konnten zusätzlich zeigen, dass dieser Phänotyp nicht auf polaren Effekten der Deletionen beruht. Die Transkription der Hydrogenase ist in den Mutanten nicht betroffen und schliesst daher ihre Regulation über die hyp-Gene aus. Das Enzym wird nicht mehr korrekt assembliert und zeigt deswegen in den Deletionsmutanten keine Aktivität mehr. Des weiteren konnte für die Homologen von hypA und hypB gezeigt werden, dass diese sich nicht gegenseitig komplementieren können. Die Hydrogenaseaktivität für die hypA1- und die hypB1- Deletionsmutanten konnte mit steigender Nickel-Konzentration angehoben werden, daher haben die Proteine HypA1 und HypB1 wahrscheinlich die gleiche Funktion der Insertion von Nickel ins aktive Zentrum in Synechocystis wie ihre Homologen in E. coli. Die HypA- und HypB-Proteine haben keine Funktion in der Reifung der Urease, wie es in Helicobacter pylori der Fall ist (Olson et al., 2001). Es kann aufgrund der Ergebnisse davon ausgegangen werden, dass die Hyp-Proteine, mit Ausnahme von HypA2 und HypB2, die gleichen Funktionen innehaben wie ihre Homologen in E. coli. Ein Komplex aus HypC und HypD bindet das Eisen, HypE und HypF sind für die Anlagerung der anorganischen Liganden Kohlenmonoxid und zwei Cyaniden zuständig, HypA1 und HypB1 inserieren das Nickel-Ion ins aktive Zentrum und HoxW spaltet als Protease den C-Terminus ab (abgeleitet aus Blokesch et al., 2002). Dadurch wird die prozessierte große Untereinheit der Hydrogenase HoxH erhalten, die sich dann mit der kleinen Untereinheit zusammenlagern kann und das aktive Enzym herstellt. Des weiteren wurde eine Mutante von Synechocystis sp. PCC 6803 hergestellt, in der das Protein HypX aus Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha) exprimiert wurde. HypX fügt in Cupriavidus necator einen zusätzlichen Cyanid-Liganden an das Nickel im aktiven Zentrum an. Die Mutante zeigte jedoch keine gesteigerte Hydrogenaseaktivität und Stabilität. Es wurden Metalltransporter charakterisiert, und zwar konnte für HupE gezeigt werden, dass dieser Transporter vor allem für den Cobalt-Transport in die Zelle zuständig ist, allerdings unspezifisch auch einen geringen Anteil an Nickel transportiert. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass das Cobalt für die Methionin-Synthase benötigt wird. Daraufhin konnte bewiesen werden, dass das cbi-Gencluster für einen Nickel-Transporter kodiert, der für die Hydrogenase essentiell ist. Durch die Aufreinigung des Proteins SpeB2 konnte es als im Arginin-Abbauweg beteiligt charakterisiert werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass es 4-Guanidinobutyrat und Arginin umsetzen kann. Da die Aktivität des Proteins um 60 % gesteigert werden konnte, wenn es mit HypA2 und HypB2 exprimiert wurde, konnte nachgewiesen werden, dass diese beiden Proteine für die Assemblierung des SpeB2 zuständig sind. Weiterhin wurde Mangan als das Metall im aktiven Zentrum identifiziert.

In this thesis the maturation of the bidirectional [NiFe]-hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 was investigated through deletion mutants of the accessory genes. The hydrogenase activity measurements of the deletion and insertion mutants of hypA1 (slr1675), hypA2 (sll1078), hypB1 (sll1432), hypB2 (sll1079), hypC (ssl3580), hypD (slr1498), hypE (sll1462), hypF (sll0322) and hoxW (slr1876) showed that all of these genes -except of hypA2- and hypB2- are coding for Hyp-proteins which are essentiell for the processing of the hydrogenase. Complementation mutants showed that the phenotype of the deletions is not depending on polar side effects. The transcription of the hydrogenase in these mutants was not affected excluding that the hyp-genes have any regulation influence. In the deletion mutants the enzyme is not assembled correctly so that it is not active anymore. The homologs of hypA and hypB are not able to complement each other. The hydrogenase activity could be increased in the hypA1- and hypB1-deletion mutants with a raised nickel concentration and this suggests that the proteins HypA1 and HypB1 have a similar role in incorporation of nickel in the active site in Synechocystis like it is known for E. coli. The HypA- and HypB- proteins have no function in the maturation of the urease like it is the case in Helicobacter pylori (Olson et al., 2001). The results suggest that the Hyp-proteins except of HypA2 and HypB2 have the same functions as their homologues in E. coli. A complex of HypC and HypD binds iron, HypE and HypF introduce the anorganic ligands carbon monoxide and two cyanides, HypA1 and HypB1 insert the nickel-ion in the active site and HoxW cleaves the C-terminus as a protease (adapted from Blokesch et al., 2002). The large subunit HoxH processed by this mechanism, binds the small subunit and forms the active enzyme. Additionally a mutant of Synechocystis sp. PCC 6803 was constructed containing the expressed protein HypX from Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha). However, the mutant showed no increased hydrogenase activity and stability. Furthermore, metall transporter were characterized and HupE was shown to be a transporter of cobalt in the cell although a small amount of nickel is transportet as well. It was proved that this cobalt is needed for the methionine-synthase. In addition it could be shown that the gene cluster of cbi which encodes a nickel transporter that is essentiell for the hydrogenase. By the purification of the protein SpeB2 it was shown that this protein is important in the arginine degradation pathway. It is metabolizing 4-guanidinobutyric acid and arginine. The activity is increased about 60 % if it is expressed with HypA2 and HypB2. Therefore, these two proteins are necessary for the assembly of SpeB2. Manganese was identified to be the transition metall of the active site.

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Hoffmann, Dörte: Charakterisierung der für die Reifung der Hydrogenase und anderer Metall-Enzyme von Synechocystis sp. PCC 6803 zuständigen Gene.

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