Untersuchungen zur in vivo Funktion der Aspartylprotease BACE1

Rittger, Andrea

Die Alzheimersche Erkrankung ist die häufigste altersbedingte Form der Demenz. Bisher gibt es keine wirksame Therapie, die den Ausbruch und die Progression der Krankheit verhindern kann. Einen vielversprechenden Ansatz für die Therapie stellt zur Zeit die Inhibition der β-Sekretase BACE1 dar. Die Aspartat-Protease BACE1 (β-site APP cleaving enzyme) ist an der Generierung des neurotoxischen Amyloid β-Peptids beteiligt und trägt somit maßgeblich zur molekularen Pathogenese der Alzheimer-Kankheit bei. Neben dem β-Amyloid-Vorläufer-Protein βAPP konnten zahlreiche weitere Substrate von BACE1 identifiziert werden. Diese Substrate sind unter anderem an immunologischen Prozessen (PSGL-1, St6GalI, IL1-RII) und an der Erregbarkeit von Neuronen (Untereinheiten der spannungsabhängigen Natriumkanäle β2/β4) beteiligt. Über die genaue physiologische Funktion von BACE1 ist bisher jedoch wenig bekannt. Die phänotypischen und biochemischen Untersuchungen eines BACE1-defizienten Mausmodells sollten näheren Einblick für die Bedeutung von BACE1 in vivo geben. Ein wichtiger Ansatz waren dabei Studien zur Funktion und Regulation des Immunsystems. Es zeigte sich, dass der Verlust von BACE1 in Mäusen zu einer Reduktion der B-Zellen in der Milz, sowie zu niedrigeren Immunglobulinkonzentrationen im Serum führt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass BACE1-defiziente Mäuse anfälliger auf eine Infektion mit dem pathogenen Mikroorganismus Listeria monocytogenes reagierten als Wildtyp-Tiere. Eine mögliche Erklärung für diese immunologischen Defekte der BACE1-defizienten Mäuse könnte eine gestörte proteolytische Prozessierung von immunologisch relevanten Substraten darstellen. Deshalb stand die Identifizierung noch unbekannter Substrate von BACE1 im Vordergrund. Untersucht wurden der B-Zell aktivierende Faktor BAFF (B cell-activating factor belonging to the TNF family), TRANCE (tumor necrosis factor-related activation-induced cytokine) und ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1). Es konnte gezeigt werden, dass BACE1 TRANCE nach Überexpression im Zellkulturmodell proteolytisch spaltet. Allerdings konnte eine auf das Mausmodell übertragene Relevanz in vivo bisher nicht gezeigt werden. Für BAFF und ICAM-1 konnte eine proteolytische Prozessierung durch BACE1 nicht eindeutig belegt werden. Die gezielte Proteolyse der Ektodomäne von βAPP erfolgt entweder durch BACE1, das den N-Terminus von Aβ generiert, oder durch eine α-Sekretase, welche innerhalb der Aβ Sequenz schneidet und somit die Erzeugung von Aβ verhindert. Da die beiden Sekretasen um βAPP als Substrat konkurrieren, führt die Inhibition der einen Protease zu einer vermehrten Prozessierung durch die andere Protease. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob BACE1 die Expression und Aktivität der α-Sekretasen ADAM10 und ADAM17 beeinflusst. Erste Daten deuten an, dass BACE1 die Reifung und Aktivität der α-Sekretase ADAM17 beeinflussen könnte. In BACE1-defizienten Zellen und Geweben wurde eine Akkumulation der proteolytisch inaktiven Pro-Form sowie eine geringere proteolytische Aktivität von ADAM17 beobachtet. Die Überexpression von BACE1 resultierte dagegen in einer erhöhten ADAM17-Aktivität. Eine völlig neue, proteolyse-unabhängige Funktion von BACE1 konnte bei elektro-physiologischen Analysen des spannungsabhängigen Natriumkanals Nav1.2α beobachtet werden. BACE1 beeinflusst die Aktivierung von Nav1.2α über die Proteolyse seiner modulatorischen Untereinheiten β2 und β4, bewirkt aber auch unabhängig von den β-Untereinheiten eine erhöhte Aktivierbarkeit des Kanals. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass BACE1 im Gegensatz zu bisherigen Annahmen, an vielen weiteren und komplexeren zellulären und systemischen Prozessen beteiligt ist. Intensivere Studien des Immunsystems von BACE1-defizienten Mäusen, insbesondere der B-Zellreifung und der Listerienabwehr, sowie die Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen bezüglich der Reifung von ADAM17 und der Modulation der Natriumkanäle durch BACE1 könnten diese Hypothese bestätigen.

Alzheimer disease is the most common form of dementia in elderly people. Until now no potent therapy against the onset and progression of the disease is available. As a promising basic approach for such therapy, the inhibition of the β-secretase BACE1 (βAPP cleaving enzyme 1) is discussed. The aspartyl protease BACE1 initiates the generation of the neurotoxic amyloid β peptide (Aβ) and is therefore one of the key players in the molecular pathogenesis of Alzheimer disease. In addition to the amyloid precursor protein (βAPP) several other substrates for BACE1 could be identified. Those substrates are involved in immunity (PSGL-1, St6GalI, IL1-RII) and in neuronal excitability (VGSC β2/β4) among other functions. However the exact physiological function of BACE1 remains elusive. To gain further insight into the in vivo function of BACE1, BACE1 deficient mice were analyzed with regard to the role of this protease in the immune system. Loss of BACE1 in vivo led to a decreased number of spleenic B-cells as well as reduced levels of serum immunoglobulin. Furthermore, the fact that BACE1 deficient mice are more susceptible to infection with Listeria monocytogenes when compared with wildtype mice could be conveyed. A possible explanation for the observed immunological defects may be the impaired proteolysis of immunological relevant BACE1 substrates. Therefore, the identification of novel substrates for BACE1 was another emphasis of this work. The transmembrane proteins BAFF (B cell-activating factor belonging to the TNF family), TRANCE (tumor necrosis factor-related activation-induced cytokine) and ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1) were analyzed. TRANCE was shown to be processed by BACE1 after over-expression in cultured cells, however, no in vivo relevance could be proven. BAFF and ICAM-1 could not be identified as physiological substrates for BACE1. The targeted proteolysis of the βAPP ectodomain occurs either by BACE1, which generates the N-terminus of Aβ or by an α-secretase that cleaves inside the Aβ sequence of βAPP and therefore prevents the generation of Aβ. Since both enzymes compete for their substrate, the inhibition of one of the secretases leads to increased processing of βAPP by the other secretase. Thus, another approach of this work was to investigate whether BACE1 affects the expression and activity of the α-secretases ADAM10 and ADAM17. Preliminary results indicate that BACE1 impairs the maturation and activity of ADAM17. In BACE1 deficient cells and tissues the accumulation of pro-ADAM17 and reduced ADAM17 proteolytic activity was observed. In contrast, the over-expression of BACE1 led to increased ADAM17 activity. A completely new non-proteolytic function of BACE1 could be observed when the electrophysiological properties of the voltage gated sodium channel, Nav1.2α were analyzed. BACE1 produced complex effects on the sodium channel gating that could be only partially explained by the cleavage of the auxiliary β-subunits of the channel, which are substrates for BACE1. Co-expression of Nav1.2α with BACE1 led to increased excitability independent from the β-subunits and BACE1 proteolytic activity. Results from this work indicate that BACE1 is involved in much more complex cellular and systemic processes than previously assumed. Intensive studies of the immune system in BACE1 deficient mice, especially of B-cell development and host defense against Listeria monocytogenes, the investigation of the mechanisms of impaired ADAM17 maturation and the modulatory effects of BACE1 on channel gating could support this hypothesis.

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Rittger, Andrea: Untersuchungen zur in vivo Funktion der Aspartylprotease BACE1. 2008.

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