Neuartige Enzyme des Glucoseabbaus in Archaea : Nachweis des nicht-phosphorylierten Entner-Doudoroff-Weges in Picrophilus torridus und des modifizierten Embden-Meyerhof-Weges in Pyrobaculum aerophilum

Reher, Matthias

Vergleichende Untersuchungen der Zuckerabbauwege von Archaea haben ergeben, dass Glucose und Glucosepolymere über modifizierte Varianten des klassischen Embden-Meyerhof-Weges (EM-Wege) und Entner-Doudoroff-Weges (ED-Weg) von Bacteria und Eukarya abgebaut werden. Modifizierte ED-Wege wurden vor allem für aerobe Archaea postuliert. Für das aerobe thermoacidophile Crenarchaeon Sulfolobus wurde ein verzweigter ED-Weg vorgeschlagen, der einen nicht-phosphorylierten Zweig (npED), mit 2-Keto-3-Deoxygluconat (KDG) als Intermediat, und einen semi-phosphorylierten Zweig (spED), mit 2-Keto-3-Deoxyphosphogluconat (KDPG) als Intermediat, enthält. Das Schlüsselenzym dieses Weges ist eine bifunktionelle Aldolase, die sowohl KDG als auch KDPG mit hohen Raten umsetzt. Der glycolytische Abbauweg in aeroben thermoacidophilen Euryarchaeota, wie Picrophilus torridus und Thermoplasma acidophilum, wurde bisher nicht detailliert untersucht. Das Vorkommen einer Glucose Dehydrogenase in beiden Organismen deutet auf die Beteiligung eines ED-Weges hin. Detaillierte enzymatische Untersuchungen sowie ein Nachweis des ED-Weges in vivo lagen nicht vor. Für anaerobe hyperthermophile Archaea wurden modifizierte EM-Wege beschrieben. In dem aeroben hyperthermophilen Pyrobaculum aerophilum deuten Genomanalysen auf das Vorkommen eines EM-Weges hin. Ein enzymatischer Nachweis dieses Weges lag nicht vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die glycolytischen Abbauwege in dem thermoacidophilen Euryarchaeon Picrophilus torridus und dem aeroben hyperthermophilen Crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum analysiert und als neuartiger ED-Weg in P. torridus bzw. EM-Weg in P. aerophilum beschrieben. Der nicht-phosphorylierte Entner-Doudoroff-Weg (npED) in Picrophilus torridus Die Beteiligung eine ED-Weges in vivo wurde durch Wachstum von P. torridus mit spezifisch markierter 13C-Glucose und anschließender NMR-spektroskopischer Analyse des Alanins, einer von Pyruvat abgeleiteten Aminosäure im Zellprotein, nachgewiesen. Die Verteilung der Markierung im Alanin zeigte ausschließlich das für den ED-Weg typische Muster; C1 und C3 positionsmarkierte Glucose führte ausschließlich zu einer C1 bzw. C3 Markierung des Alanins. In Extrakten Glucose gewachsener Zellen konnten alle Enzyme eines npED-Weges nachgewiesen werden: Glucose Dehydrogenase, Gluconate Dehydratase (GAD), KDG-Aldolase, Glycerinaldehyd Dehdrogenase (GADH), Glycerat Kinase (GCK), Enolase und Pyruvat Kinase. Eine signifikante KDPG-Aldolase und KDG-Kinase Aktivität, wie sie für einen spED-Weg postuliert ist, konnte nicht nachgewiesen werden. Die Schlüsselenzyme des npED-Weges, GAD, KDG-Aldolase, GADH und GCK wurden gereinigt, charakterisiert sowie die kodierenden Gene identifiziert und phylogenetisch analysiert. Die Gluconat Dehydratase ist ein 330 kDa Oktamer. Das Enzym, welches durch Pto0485 kodiert wird, katalysiert die Umwandlung von Gluconat zu KDG. Das Enzym zeigte biochemische und phylogenetische Ähnlichkeit zu der Gluconat Dehydratase von S. solfataricus. Die KDG-Aldolase ist ein 120 kDa Homotetramer. Das Enzym, welches durch Pto1279a kodiert wird, katalysiert die reversible Umsetzung von KDG zu Glycerinaldehyd und Pyruvat. Die Aldolase zeigte eine hohe Spezifität für KDG; KDPG wurde nur mit äußerst niedriger katalytischer Effizienz umgesetzt. Dies unterscheidet die KDG-Aldolase von P. torridus von der bifunktionellen KD(P)G-Aldolase von Sulfolobus, die sowohl KDPG als auch KDG mit hohen Raten umsetzt. Die ungewöhnliche Substratspezifität für KDG sowie phylogenetischen Analysen charakterisieren das Enzym aus P. torridus als neuartige KDG spezifische Aldolase. Die Glycerinaldehyd Dehydrogenase (GADH) ist ein 120 kDa Homodimer. Das Enzym, welches durch Pto0332 kodiert wird, katalysiert die Oxidation von Glycerinaldehyd zu Glycerat mit NADP+ als Cofaktor. Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Glycolaldehyd wurden mit signifikant geringeren Effizienzen umgesetzt. Das GADH Homolog aus T. acidophilum, Ta0809, wurde identifiziert und nach heterologer Expression des Proteins als GADH charakterisiert. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass diese euryarchaeellen GADHs eine eigenständige Familie innerhalb der Aldehyd Dehydrogenase (ALDH)-Superfamilie repräsentieren. Die Glycerat Kinase ist ein 95 kDa Homodimer. Das Enzym, welches durch Pto1442 kodiert wird, katalysiert die ATP-abhängige Phosphorylierung von Glycerat spezifisch zu 2-Phosphoglycerat. Homologe dieser ersten archaeellen GCK mit glycolytischer Funktion fanden sich auch in den Genomen von Thermoplasma und Sulfolobus. Die Daten zeigen, dass P. torridus Glucose über einen npED-Weg mit einer neuartigen KDG spezifischen Aldolase und Glycerinaldehyd Dehydrogenase als Schlüsselenzyme abbaut. Dies ist die erste detaillierte Beschreibung eines funktionellen npED-Weges, der sich von dem postulierten verzweigten ED-Weg der Crenarchaeota, wie Sulfolobus Spezies, deutlich unterscheidet. Der modifizierte Embden-Meyerhof-Weg (EM) in Pyrobaculum aerophilum In Extrakten Maltose-gewachsener Zellen des aeroben Crenarchaeons P.aerophilum konnten alle Enzyme eines modifizierten EM-Weges nachgewiesen werden: ATP-abhängige Glucokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, ATP-abhängige Phosphofructokinase, Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase, Triosephosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat: Ferredoxin-Oxidoreduktase (GAPOR), 3-Phosphoglycerat-Mutase, Enolase und Pyruvat-Kinase. Schlüsselenzyme von ED-Wegen (KD(P)G-Aldolase, Gluconat Dehydratase) waren in P. aerophilum nicht nachweisbar. Das Schlüsselenzym des modifizierten EM-Weges, eine durch Maltose induzierbare GAPOR, wurde gereinigt, charakterisiert, das kodierende Gen identifiziert und phylogenetisch untersucht. Diese GAPOR aus einem aeroben Organismus zeigte biochemische und phylogenetische Ähnlichkeiten zu den homologen Enzymen aus strikt anaeroben hyperthermophilen Archaea. Dies ist der erste Nachweis eines modifizierten EM-Weges in einem aeroben Archaeon mit einer funktionellen GAPOR als Schlüsselenzym.

Comparative studies on central carbohydrate metabolism revealed that Archaea utilize glucose and glucose polymers via modifications of the classical Embden-Meyerhof (EM) and Entner-Doudoroff (ED) pathways of Bacteria and Eucarya. Modified ED pathways have been postulated primarily for aerobic Archaea. In the aerobic thermoacidophilic crenarchaeon Sulfolobus glucose is metabolized via a branched ED pathway, involving both a non-phosphorylative branch (npED) with 2-keto-3-deoxygluconate (KDG), and a semi-phosphorylative branch (spED) with 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate (KDPG) as intermediates. The key enzyme of this pathway, a bifunctional aldolase, catalyzes the cleavage of both KDG and KDPG at high rate. The glycolytic pathways in thermoacidophilic euryarchaeota, e.g. Picrophilus torridus and Thermoplasma acidophilum, have not been studied in detail. The presence of glucose dehydrogenase in both organisms indicates that glucose could be metabolized via the ED pathway. So far, detailed enzymological studies as well as demonstration of the ED pathway in vivo have not been described. In anaerobic hyperthermophilic Archaea the operation of modified EM pathways have been described. Genomics-based analysis indicates the operation of a modified EM pathway in the aerobic hyperthermophilic Pyrobaculum aerophilum. However, this pathway has not been analyzed by enzymological studies. In this study the pathway of glucose degradation in the thermoacidophilic euryarchaeon Picrophilus torridus and in the aerobic hyperthermophilic creanarchaeon Pyrobaculum aerophilum is analyzed. A novel modified ED pathway and modified EM pathway are described in P. torridus and in P. aerophilum, respectively. Non-phosphorylative Entner-Doudoroff pathway (npED) in Picrophilus torridus The operation of an ED pathway in vivo is demonstrated by growth of P. torridus with specific labelled 13C-glucose following analysis of the distribution of labelled alanine formed from pyruvat in cell protein by NMR spectroscopy. Addition of 1-13C-glucose or 3-13C-glucose to the growth media resulted only in the formation of C1 and C3 alanine, respectively. These labelling patterns showed that glucose is utilized exclusively by the ED pathway. Cell extracts of P. torridus grown on glucose contain all enzyme activities of an npED pathway: glucose dehydrogenase, gluconate dehydratase (GAD), KDG-aldolase, glyceraldehyde dehydrogenase (GADH), glycerate kinase (GCK), enolase and pyruvate kinase. No significant activity of KDPG aldolase and KDG kinase involved in spED pathway could be detected. Key enzymes of npED pathway (GAD, KDG aldolase, GADH and GCK) were purified, characterized and the respective encoding genes were identified and studied by phylogenetic analysis. Gluconate dehydratase, a 330-kDa oktameric enzyme, catalyzes the conversion of gluconat to KDG. ORF Pto0485 was identified as encoding gene. Gluconate dehydratase from P. torridus showed biochemical and phylogenetic similarity to that from S. solfataticus. KDG aldolase, a 120-kDa homotetrameric enzyme, catalyzes the reversible cleavage of KDG to glyceraldehyde and pyruvate. ORF Pto1279a was identified as encoding gene. This enzyme showed a high specificity for KDG, KDPG being cleaved at extremely low catalytic efficiency. In contrast to KDG aldolase from P. torridus, the bifunctional KDPG/KDG aldolase from Sulfolobus has been proposed to be operative in both KDG and KDPG cleavage at high rate. Based on the unusual substrate specificity for KDG and phylogenetic analysis, the KDG specific aldolase is proposed to be a novel type of aldolase. Glyceraldehyde dehydrogenase (GADH), a 120-kDa homodimeric protein, catalyzes the oxidation of glyceraldehyde to glycerate, using NADP+ as a cofactor. ORF Pto0332 was identified as encoding gene. Glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde were accepted as substrates at significant low catalytic efficiency. A GADH homolog from T. acidophilum was identified, the gene was expressed and the recombinant protein was characterized as GADH. The phylogenetic analysis defined these euryarchaeal GADHs as members of a novel enzyme family within the aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily. Glycerate kinase, a 95-kDa homodimeric protein, catalyzes the ATP dependent phosphorylation of glycerate specifically to 2- phosphoglycerate (2-PG). ORF Pto1442 was identified as encoding gene. The first archaeal glycerate kinase homologs showing glycolytical function were identified in the genomes of the archaea Thermoplasma and Sulfolobus. The data presented indicate that in P. torridus glucose is degraded via an npED pathway involving a novel type of a KDG specific aldolase and Glyceraldehyde dehydrogenase as key enzymes. This is the first detailed description of the npED pathway, which is clearly distinguishes from the branched ED pathway proposed for the crenarchaeon Sulfolobus. Modified Embden-Meyerhof pathway (EM) in Pyrobaculum aerophilum Cell extracts of the aerobic crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum, grown on maltose, contained all enzyme activities of a modified EM pathway, including ATP dependent glucokinase, glucose-6-phosphate isomerase, ATP dependent 6-phosphofructokinase, fructose-1,6-phosphate aldolase, triosephosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate: ferredoxin oxidoreductase (GAPOR), 3-phosphoglycerate mutase, enolase and pyruvat kinase. Key enzymes of ED pathway, KD(P)G aldolase, gluconate dehydrogenase could not be detected. A key enzyme of modified EM pathway, GAPOR induced by maltose, was purified and characterized. The encoding gene was identified and studied by phylogenetic analysis. P. aerophilum GAPOR showed biochemical and phylogenetic similarity to enzymes from strictly anaerobic hyperthemophlic Archaea. This is the first evidence of a modified EM pathway in aerobic Archaea with a functional GAPOR as key enzyme.

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Reher, Matthias: Neuartige Enzyme des Glucoseabbaus in Archaea : Nachweis des nicht-phosphorylierten Entner-Doudoroff-Weges in Picrophilus torridus und des modifizierten Embden-Meyerhof-Weges in Pyrobaculum aerophilum.

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