MHC polymorphism in the three-spined stickleback and its role in host-parasite co-evolution

Lenz, Tobias L.

Natural genetic variation is the raw material for evolution and in vertebrates the most polymorphic part of the genome is represented by the major histocompatibility complex. This complex is part of the adaptive immune system and plays a key role in the recognition of invading pathogens. The exceptional polymorphism of these genes is potentially the result of an ongoing arms race between vertebrate hosts and their parasites, also called the Red Queen Hypothesis, which is facilitated by genetic recombination and therefore maintains sexual reproduction. Genes in this region are known to influence parasite resistance and mating decisions in several species, including the three-spined stickleback Gasterosteus aculeatus. This fish has long been a model species for behavioural studies and is currently also becoming a model system in evolutionary ecology and genetics. With the available knowledge about its behavioural ecology, parasite community and first insights into the genetics of the stickleback MHC, it provides a perfect tool to investigate and disentangle the mechanisms that drive host-parasite co-evolution and potentially the maintenance of sexual reproduction. Previous work on the MHC in the three-spined stickleback has mainly focussed on overall genetic diversity, but already found first hints for allele-specific host-pathogen interactions. To follow up on these results and further unravel the mechanisms of host-parasite co-evolution, I started my PhD with the development of a new MHC typing protocol, which is optimised for highly polymorphic loci and based on reference strand-mediated conformation analysis. The new protocol includes new primers that reliably amplify all known MHC class IIB alleles and was thoroughly verified by cloning and sequencing. It enables reliable detection and recognition of individual MHC alleles to the sequence level and therefore provides an important new tool for evolutionary studies in the stickleback. The first pilot screens gave already interesting results in terms of chromosomal organisation of the MHC with tight linkage between amplified MHC class IIB loci and potential polymorphism in the number of loci between haplotypes. The allele specificity also allowed a new experimental level, which was applied in an experiment with semi-natural enclosures. We selected wild-caught individual sticklebacks with specific MHC IIB genotypes and let them reproduce under semi-natural conditions where they encountered their natural parasites, but were protected from predators. During the full reproductive period, we collected eggs and determined parenthood from microsatellite typing. Parental assignment in combination with MHC genotyping revealed mate choice for intermediate genetic distance between mates, but not for specific haplotypes. Further analysis also showed effects of MHC IIB diversity and a haplotype on individual conditional and immunological parameters as well as parasite resistance. Sticklebacks are known for their potential to adapt to new environments and show high diversification in many different habitats across their distributional range. This diversification potentially also includes adaptation to new parasite communities. In another experiment, we therefore tested two local stickleback populations for levels of local immunogenetic adaptation. These populations had been shown in previous studies to be differentiated and reproductively isolated and it has been suggested that this is based on locally specialised cycles of host-parasite co-evolution. We reciprocally exposed lab-bred hybrid and pure line F2 fish to their native and to the foreign habitat. We found MHC-linked as well as genome-wide local adaptation. However the interactions turned out to be more complex than expected and were dependent on the life-history strategy of the parasites. These results show that more focussed experiments are needed to understand the interaction of host and parasite genotypes. In the last and still ongoing project, we are increasing the focus and test experimentally, whether frequency-dependent selection between a host and a single parasite can occur. Although this is a widely hypothesised mechanism for the maintenance of MHC polymorphism, it could not be verified in vertebrates yet. Here we infected two groups of lab bred fish each with one of two sympatric nematode parasites, let them reproduce in a common garden set up and re-infected their offspring. We hypothesize that under natural selection and amplified by sexual selection, the more resistant genotypes will show increased reproductive success and that the resistance is transmitted to the offspring. This will lead to an increase of the resistant host genotype and a decrease of the parasite in the offspring generation and by that fulfil the definition of negative frequency-dependent selection. The data collection has been finished, but the analysis is still ongoing. We will also include host MHC genotypes in the analysis to understand the extent of host allele-parasite associations, which could ultimately explain the exceptional polymorphism in the MHC. The here presented studies provide a more detailed view on the extensive polymorphism of the MHC in the three-spined stickleback and give further insights into the key role that this gene complex has in the arms race between hosts and parasites, mediated through its pleiotropic role in mate choice and parasite resistance.

Natürliche genetische Variabilität ist die Basis für Evolution und bei Wirbeltieren finden sich die variabelsten Gene im Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex, MHC). Dieser Genkomplex ist Teil des erworbenen Immunsystems und spielt eine wichtige Rolle bei der Erkennung von körperfremden Erregern. Die außergewöhnliche Variabilität dieser Gene ist vermutlich das Ergebnis eines ständigen Wettrüstens zwischen Wirten und ihren Parasiten, auch als Red Queen Hypothese bekannt, das durch genetische Rekombination erleichtert wird und dadurch auch sexuellen Fortpflanzung bevorzugt. Die Gene in dieser Region sind dafür bekannt in mehreren Arten Parasitenresistenz und Partnerwahl zu beeinflussen, so auch beim dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus). Dieser Fisch ist seit langem ein Modellorganismus für Verhaltensstudien und entwickelt sich derzeit auch zu einem Modellsystem für evolutionäre Ökologie und Genetik. Durch das verfügbare Wissen über ihre Verhaltens-Ökologie, ihre Parasiten und erste Einblicke in die Genetik des Stichlings-MHC bietet diese Art ein perfektes Werkzeug zur Untersuchung und Entschlüsselung der Mechanismen, die Wirt-Parasit-Koevolution und potenziell auch die Erhaltung der sexuellen Fortpflanzung steuern. Frühere Arbeiten über den MHC im dreistachligen Stichling haben sich größtenteils mit der genetischen Diversität befasst, aber bereits erste Hinweise für allel-spezifische Wirts-Pathogen-Interaktionen gefunden. An diese Erkenntnisse anschließend und mit dem Ziel, die Mechanismen der Wirt-Parasit Koevolution besser zu verstehen, begann ich meine Promotion mit der Entwicklung eines neuen MHC Typisierungsprotokolls. Diese neue Methode wurde optimiert für hoch variable Loci und basiert auf der Referenzstrang-vermittelten Konformationsanalyse (RSCA). Das neue Protokoll basiert zusätzlich auf neuen Primern, die alle bisher bekannten MHC Klasse IIB Allele des Stichlings amplifizieren und wurde durch Klonierung und Sequenzierung verifiziert. Es ermöglicht die zuverlässige Auftrennung und Erkennung individueller MHC Allele bis auf Sequenzebene und bietet dadurch ein wichtiges neues Werkzeug für evolutionäre Studien mit dem dreistachligen Stichling. Erste Untersuchungen ergaben bereits interessante Ergebnisse im Bezug auf die chromosomale Organisation des MHC, mit enger Kopplung zwischen einzelnen MHC Klasse IIB Loci und potenzieller Variabilität in der Anzahl der Loci zwischen Haplotypen. Die Allelspezifität der neuen Methode erlaubt auch eine neue experimentelle Ebene, die in einem Experiment unter naturnahen Bedingungen angewandt wurde. Wir selektierten wild-gefangene Stichlinge mit spezifischen MHC IIB Genotypen und ließen sie unter semi-natürlichen Bedingungen reproduzieren, wo sie auf ihre natürlichen Parasiten trafen, aber vor Räubern geschützt waren. Während des gesamten Fortpflanzungszeitraums sammelten wir die befruchteten Eier und bestimmten anschließend die Elternschaft anhand von Mikrosatelliten. Die elterliche Zuordnung in Kombination mit der MHC-Genotypisierung ergab für die Partnerwahl eine Bevorzugung für Paare mit mittlerer MHC-genetischer Distanz zwischen den Partnern, aber keine Bevorzugung für bestimmte Haplotypen. Weitere Analysen zeigten auch Auswirkungen der MHC IIB Diversität und eines Haplotyps auf einzelne Konditions- und immunologische Parameter sowie auf Parasitenresistenz. Stichlinge sind bekannt für ihr Potential zur Anpassung an neue Umweltbedingungen und weisen eine hohe Diversifizierung in viele verschiedene Lebensräume innerhalb ihres Verbreitungsgebietes auf. Diese Diversifizierung beinhaltet vermutlich auch Anpassung an neue Parasitengemeinschaften. In einem weiteren Experiment haben wir daher zwei Stichlingspopulationen auf ihre lokale immungenetische Anpassung hin untersucht. Diese Populationen hatten sich schon in früheren Studien als genetisch unterschiedlich und reproduktiv isoliert herausgestellt, und eine Aufspaltung aufgrund von lokal spezialisierten Zyklen der Wirts-Parasit Koevolution war hypothetisiert worden. Wir setzten Hybride und reine Linien einer laborgezüchteten F2 Generation ihren heimischen und reziprok den jeweils fremden Lebensräumen aus. Wir fanden sowohl MHC-basierte als auch genomweite lokale Anpassung an die jeweilige Parasitenfauna. Die Interaktionen erwiesen sich als komplizierter denn erwartet, und waren abhängig von der Infektionsstrategie der jeweiligen Parasiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass weitere Experimente notwendig sind, um die Interaktion von Wirts- und Parasitengenotypen zu verstehen. Im letzten, noch andauernden Projekt Erhöhen wir die Fokussierung und testen experimentell, ob die negativ-frequenzabhängige Selektion zwischen einem Wirt und einem einzigen Parasiten auftreten kann. Obwohl es sich hierbei um einen weithin hypothetisierten Mechanismus für die Aufrechterhaltung der MHC-Variabilität handelt, konnte er bisher bei Wirbeltieren noch nicht verifiziert werden. Wir infizierten hierfür zwei Gruppen von laborgezüchteten Stichlingen mit jeweils einer von zwei parasitischen Nematodenarten, ließen sie unter 'common garden' Bedingungen reproduzieren und infizierten ihre Nachkommen mit den gleichen Parasiten. Unsere Hypothese war, dass unter natürlicher Selektion und verstärkt durch sexuelle Selektion, die parasitenresistenteren Genotypen einen erhöhten reproduktiven Erfolg aufweisen würden und dass diese Resistenz an die Nachkommen vererbt würde. Dies würde zu einem Anstieg des resistenten Wirtsgenotyps und einem Rückgang des Parasiten in der Generation der Nachkommen führen und damit die Definition der negativen frequenzabhängigen Selektion erfüllen. Die Datenerhebung für dieses Experiment ist abgeschlossen, aber die Auswertung ist noch im Gange. Zusätzlich werden wir auch MHC-Genotypen in die Analyse einbringen, um das Ausmaß der Wirtsallel zu Parasit Assoziation zu verstehen, welche letztlich den außergewöhnlichen Polymorphismus im MHC erklären könnte. Die hier vorgelegten Studien liefern eine detailliertere Sicht auf die außerordentliche Variabilität des MHC im dreistachligen Stichling und geben weitere Einblicke in die entscheidende Rolle, die dieser Gen-Komplex im Rüstungswettlauf zwischen Wirt und Parasiten, vermittelt durch seine pleiotrope Rolle in Partnerwahl und Parasitenabwehr, erfüllt.

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Lenz, Tobias L.: MHC polymorphism in the three-spined stickleback and its role in host-parasite co-evolution.

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