Leben ohne LAMPs : die Folgen des Fehlens der lysosomal assoziierten Membranproteine LAMP-1 und LAMP-2 auf endosomale/lysosomale Prozesse

Schneede, Alexander

Die beiden abundanten lysosomal assoziierte Membranproteine LAMP-1 und LAMP-2 stellen fast die Hälfte der Proteinmasse aller lysosomalen Membranproteine. Da die LAMPs eine Glykokalix bilden, indem sie aufgrund ihrer Glykosylierung eine kontinuierliche Kohlenhydratschicht auf der Innenseite der Membran von späten Endosomen und Lysosomen generieren, wurde ihre ursprüngliche Aufgabe in der Erhaltung der strukturellen Integrität dieser Membran durch den Schutz vor den lysosomalen Hydrolasen vermutet. Um Funktionen der beiden lysosomalen Membranproteine LAMP-1 und LAMP-2 zu untersuchen, die über diese eher allgemeine Aufgabe hinausgehen, wurde an aktuelle Forschungsergebnisse angeknüpft. In LAMP-defizienten Mausfibroblasten wurde eine spätendosomale Cholesterolakkumulation festgestellt. Zudem wurde eine verminderte phagosomale Reifung in Makrophagen im Zusammenhang mit der Abwehr von pathogenen Mikroorganismen beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurden Auswirkungen des Fehlens der beiden abundanten lysosomalen Membranproteine LAMP-1 und LAMP-2 auf unterschiedliche Funktionen der Lysosomen in LAMP-defizienten Mausfibroblasten näher untersucht. Während der generellen Charakterisierung LAMP-defizienter Mausfibroblasten wurde eine Dislokation später Endosomen/Lysosomen in LAMP-2- und LAMP-1/2-doppeldefiziente Zellen festgestellt. In Kontrollzelllinien und den LAMP-1-defizienten Zellen schienen die späten Endosomen/Lysosomen eher perinukleär lokalisiert zu sein, in den LAMP-2- und den LAMP-doppeldefizienten Zellen hingegen in periphere Bereiche der Zelle verteilt. Die Rekrutierung der lysosomalen Hydrolase Cathepsin D zu sauren Kompartimenten war dabei nicht gestört. In fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen wurde die Verteilung von intrazellulärem Cholesterol in Wildtyp-MEFs und LAMP-defizienten MEFs analysiert. In Wildtypzellen und in LAMP-1-defizienten Zellen wurde ein perinukleäres und vesikuläres Verteilungsmustervon freiem Cholesterol festgestellt. In den LAMP-2-einzeldefizienten und im besonderen Maße in den LAMP-1/2-doppeldefizienten MEFs konnte eine Akkumulation von freiem Cholesterol in späten Endosomen und Lysosomen beobachtet werden, die mit einer Reduktion von NilRot-färbbaren Cholesterolestern einherging. In der Leber LAMP-2-defizienter Mäuse konnte die Cholesterolakkumulation und die Abnahme von Cholesterolestern in Lipidtröpfchen ebenfalls festgestellt werden. Die heterologe Expression von LAMP-2A in den doppeldefizienten MEFs reduzierte die Cholesterolakkumulation, nicht jedoch die Transfektion mit LAMP-1. Mit Hilfe von chimären Proteinen aus LAMP-1 und LAMP-2, konnte die membranproximale Hälfte der luminalen Domäne als der Bereich von LAMP-2 eingegrenzt werden, der die Cholesterolakkumulation in den LAMP-defizienten MEFs reduzieren vermag. Um die Rolle der LAMP-Proteine während der phagosomalen Reifung zu untersuchen, wurde ein Latexkügelchen-Phagozytose-Assay mit murinen Fibroblasten etabliert. Es zeigte sich, dass sowohl die lysosomale Hydrolase Cathepsin D, als auch LAMP-2 zu einem Großteil der Phagosomen in Wildtyp-MEFs rekrutiert worden war, Indikatoren für die Fusion von Phagosomen mit Lysosomen zu Phagolysosomen. In den LAMP-1/2-doppeldefizienten MEFs zeigte sich ein gravierender Maturierungsdefekt der Phagosomen bezüglich der Rekrutierung von Cathepsin D zu den Phagosomen und der Generierung eines luminalen sauren Milieus. Es konnte gezeigt werden, dass die Transfektion der LAMP-defizienten MEFs sowohl mit LAMP-1, als auch mit LAMP-2, die Wiederherstellung der phagosomalen Reifung bewirkt.

The Lysosome Associated Membrane Proteins LAMP-1 and LAMP-2 represent nearly 50 % of the total membrane protein of late endosomes and lysosomes. LAMPs form a nearly continuous carbohydrate coat on the inner surface of the lysosomal membrane. The protective function against degradation by lysosomal hydrolases was assigned to the heavy glycosylation of both LAMP proteins possibly generating a continuous glycocalyx. Recent publications revealed further biological functions of LAMP-1 and LAMP-2. Murine fibroblasts deficient for both LAMPs were shown to accumulate free cholesterol in late endosomal compartments. Additionally, impairment of phagosomal maturation led to reduced clearence of pathogenic microbials in granulocytes deficient for LAMP-2 and in mouse embryonic fibroblasts (MEF) deficient for both LAMPs. In this work the impact of the abundant lysosomal membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 on different lysosomal functions were studied. Therefore MEFs deficient in LAMP-1 and LAMP-2 expression were used. First studies revealed a dislocation of late endosomes/lysosomes in LAMP deficient MEFs. In control as well as in LAMP-1 deficient cells late endosomes were located near the nucleus. In contrast, in cells deficient for LAMP-2 or both LAMPs the late endosomal vesicles were peripherally located. Recruitment of the lysosomal hydrolase cathepsin D to acidic compartment was unaffected. Filipin staining was used to analyse the localisation of free cholesterol in wildtype and LAMP deficient MEFs. While in wildtype and LAMP-1 deficient cells the localisation of free cholesterol was observed in perinuclear structures, in LAMP double deficient and to less extent in LAMP-2 deficient cells free cholesterol accumulated in late endosomal/lysosomal compartments. In addition to the prominent accumulation of cholesterol in late endosomes/lysosomes, the double deficient MEFs harbour considerably less Nile Red stainable lipid droplets than wild type MEFs. Furthermore, LAMP-2 deficiency led to intracellular cholesterol accumulation also in tissue, not only in cultured cells. Filipin staining of liver sections showed that LAMP-2 deficient liver accumulated free cholesterol, too. A reduction of lipid droplets was observed in LAMP-2 deficient livers. Transient over-expression of LAMP-2A abolished the endo/lysosomal cholesterol accumulation in LAMP double deficient MEFs. In constrast, the over-expression of LAMP-1 could not restore normal cholesterol distribution. LAMP-2/LAMP-1 chimeric proteins were used to identify the region of the LAMP-2 protein which is critical for the rescue effect. Over-expression of a chimeric protein containing the membrane-proximal half of the luminal domain of LAMP-2 led to the correcting of cholesterol accumulation in LAMP deficient fibroblasts. These data suggest that the membrane-proximal part of the luminal domain of LAMP-2 is sufficient to effect the cholesterol homeostasis. To address functions for LAMP proteins on the phagosomal maturation, a phagocytosis assay using latex beads was established. The majority of phagosomes in wildtype MEFs recruited cathepsin D and LAMP-2 indicating a fusion of phagosomes with lysosomes. In LAMP-1/2 double deficient MEFs the phagosomal recruitment of cathepsin D and the acidification of the phagosomal lumen were dramatically reduced. Transient expression of LAMP-1 and LAMP-2, respectively could reconstitute phagosomal maturation.

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Schneede, Alexander: Leben ohne LAMPs. die Folgen des Fehlens der lysosomal assoziierten Membranproteine LAMP-1 und LAMP-2 auf endosomale/lysosomale Prozesse. 2009.

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