Erkennung von bakteriellen Lipopeptiden durch Toll-like Rezeptor 2/1- und Toll-like Rezeptor 2/6-Heterodimere

Farhat, Katja

Lipoproteine sind ein wesentlicher Bestandteil bakterieller Membranen und in der Lage, als starke Stimulatoren des angeborenen Immunsystems, sowie als potente Adjuvanzien des adaptiven Immunsystems zu fungieren. Allen Lipoproteinen gemeinsam ist ein konserviertes, N-terminales Glycerylcystein, welches durch 2 oder 3 Fettsäuren acyliert ist. Als Dipeptid stellt es die minimale aktive Struktur dar, die von Zellen des Immunsystems durch den Toll like Rezeptor 2 (TLR2) erkannt wird. Bisher wurden in Säugern 13 verschiedene TLR identifiziert. Der TLR2 ist dabei einzigartig in seiner Fähigkeit, mit den Korezeptoren TLR1 oder TLR6 Heterodimere zu bilden, die der Ligandenerkennung und Signaltransduktion dienen. Die bisherigen Erkenntnisse wurden durch Studien an humanen und murinen Rezeptoren erhalten, so dass die Untersuchung einer weiteren Spezies zusätzliche Informationen über die Erkennung verschiedener Lipopeptide erbringen sollte. Dabei konnte in bovinen Zelllinien sowie in primären bovinen Zellen erstmals die vollständige Sequenz des Rinder-TLR1 nachgewiesen und kloniert werden. Funktionelle Untersuchungen mit Hilfe synthetischer Lipopeptide im HEK293-System zeigten, dass bovine TLR2/1-Heterodimere, ähnlich den humanen, nur durch triacylierte Lipopeptide mit Fettsäureketten von einer Länge von mindestens 12 C-Atomen aktiviert werden, während murine TLR2/1-Heterodimere schon Lipopeptide mit vergleichsweise kurzen Fettsäuren (6 C-Atome) erkennen. Neben definiert TLR1- oder TLR6-abhängigen Lipopeptiden gibt es auch solche, die sowohl in TLR1- als auch in TLR6-defizienten Zellen eine Signaltransduktion induzieren. Durch Generierung von TLR1- und TLR6-doppelt-reprimierten Zellen mittels RNA-Interferenz, konnte erstmals gezeigt werden, dass diese Liganden in Abwesenheit beider Korezeptoren nicht erkannt werden, sie also beide Heterodimere und nicht etwa ein mögliches TLR2 Homodimer aktivieren. In der vorliegenden Arbeit sollte ferner geklärt werden, ob TLR2/1- und TLR2/6-Heterodimere nach der Stimulation unterschiedliche oder identische Signalwege aktivieren. Durch einen Vergleich der induzierten Signalkaskaden, der involvierten Adaptermoleküle und von MAP-Kinasen konnten zum Teil nur geringe Unterschiede nachgewiesen werden. Bei weiteren umfassenden Untersuchungen lag die Arbeitshypothese zu Grunde, dass die Aktivierung unterschiedlicher Signalwege zur Induktion unterschiedlicher Genexpressionsprofile führt. Mikroarray-Analysen zeigten jedoch eine identische Genmodulation nach Aktivierung der TLR2/1- und TLR2/6-Heterodimere durch die entsprechenden Lipopeptide. Cluster-Analysen und real time PCR-Ergebnisse belegten diese Befunde. Das Vorhandensein der beiden TLR2-Heterodimere stellt somit eher einen evolutionären Mechanismus zur Vergrößerung des Ligandenspektrums dar und resultiert nicht in unterschiedlichen Immunantworten der Zelle nach Erkennung unterschiedlicher Lipopeptide von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien sowie von Mykoplasmen. Die induzierten Signalwege spielen aber nicht nur eine Rolle bei der Etablierung einer angeborenen Immunantwort, sondern nehmen im Zuge der adjuvanten Wirkung von Lipopeptiden auch Einfluss auf die Ausbildung einer adaptiven Immunantwort. In einem Maus-Immunisierungsmodell konnte durch Verwendung des Lieschgras-Majorallergens Phl p 1, die adjuvante Wirkung des Lipopeptids FSL-1 aufgezeigt werden. Zum einen wurde eine vermehrte Freisetzung Allergen-spezifischer Immunglobuline der Klasse IgG1 nachgewiesen. Zum anderen ist jedoch hervorzuheben, dass die adjuvante Aktivität des Lipopeptids zu einer Induktion von IgG2a führte, was ein Indiz für die Verschiebung der TH2 dominierten Immunantwort in Richtung einer TH1 Immunantwort darstellt. Beides konnte in TLR6 defizienten Tieren nicht mehr beobachtet werden, so dass die essentielle Beteiligung dieses Korezeptors auch an der FSL-1-induzierten Modulation der adaptiven Immunantwort in vivo nachgewiesen werden konnte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Spezies-spezifischen Ligandenerkennung, Heterodimerisierung und der resultierenden Signaltransduktion, sowie der Modulation der adaptiven Immunität durch bakterielle Lipopeptide, liefern neue Erkenntnisse über die Aktivierung der TLR2-Heterodimere und ihre Bedeutung für eine Immunantwort.

Lipoproteins represent an important constituent of the bacterial cell wall and are known to be strong stimulators of the innate immune system as well as potent adjuvants of the adaptive immune system. All lipoproteins are composed of a conserved N-terminal glycerylcysteine which can be acylated with 2 or 3 fatty acids. As a dipeptide it demonstrates the minimal active structure, that is recognized by immune cells through toll-like receptor 2 (TLR2). Until now there are 13 different TLR identified in mammals. Among them, TLR2 is unique in its ability to form heterodimers with TLR1 or TLR6 to mediate ligand recognition and signal transduction. Most of our knowledge is based on studies using human or murine TLR. One aim was to investigate the TLR of another species to get further insights into the requirements for lipopeptide recognition by TLR2 and its coreceptors. Thereby the full-lenght bovine TLR1 was identified in bovine cell lines and primary cells for the first time. Subsequent cloning and functional analyses using HEK293 cells and synthetic lipopeptides revealed, that bovine TLR2/1 heterodimers recognize triacylated lipopeptides with acid chains of at least 12 carbon atoms. This observation indicated similarity to the human heterodimer while the murine TLR2/1 dimer could already be activated by lipopeptides with shorter fatty acids (6 carbon atoms). Besides lipopeptides that show a distinct TLR1 or TLR6 dependency there are others which are able to induce signal transduction in TLR1- and in TLR6-deficient cells. By using RNA interference to obtain cells diminished in both coreceptors it was demonstrate that these lipopeptides are no longer recognized, indicating that they use both TLR2 heterodimers and no putative TLR2 homodimer to mediate signal transduction. Another aim was to investigate whether activation of TLR2/1 and TLR2/6 heterodimers would induce different or identical signal transduction pathways. By comparing the induced signaling pathways, involved adaptor molecules and MAP kinases small differences could be detected. By reason that differences in the signal transduction pathways would result in different gene expression patterns microarray analyses were performed. However, stimulation of the different TLR2 heterodimers with respective lipopeptides resulted in the induction of an identical gene modulation. Cluster analyses and real-time PCR verified these results. In conclusion, heterodimerization of TLR2 with TLR1 or TLR6 has been evolutionary developed to enable the innate immune system to broaden the ligand spectrum for recognizing the variety of different lipopeptides from Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as mycoplasma rather than to induce different immune responses to the different lipopeptides. Besides playing an important role in establishing an innate immune response, through their adjuvant properties lipopeptides are also critically involved in modulating adaptive immune responses. In a mouse immunization model using the Timothy grass pollen major allergen Phl p 1 the adjuvant activity of the synthetic lipopeptide FSL-1 could be demonstrated. FSL-1 was able to enhance the concentration of Phl p 1-specific immunoglobulin IgG1 and more importantly induced the production of IgG2a, thereby shifting allergen-mediated TH2- immune response towards a TH1-immune response. This effect could not be observed in TLR6 deficient mice thereby emphasising the importance of TLR6 in the FSL-1-induced modulation of the adaptive immune response in vivo. Taken together, the data on species-specific ligand recognition, heterodimerization and signal transduction as well as modulation of the adaptive immune system by bacterial lipopeptides provide new insights into the function of TLR2 heterodimers and their relevance for the immune system.

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Farhat, Katja: Erkennung von bakteriellen Lipopeptiden durch Toll-like Rezeptor 2/1- und Toll-like Rezeptor 2/6-Heterodimere.

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