Einfluss des humanen Intermediate Conductance K+-Channel hIK1 auf die Ca2+-Homöostase in menschlichen Keratinozyten

Bergmann, Philipp

Die Haut des Menschen erfüllt eine Vielzahl an Aufgaben, dabei ist die ausgewogene Balance von Proliferation und Differenzierung ihrer Zellen wesentliches Element einer intakten Funktion. Durch die hohe Zellteilungsrate im Stratum basale gelangen die Keratinozyten in oberflächlich gelegene Schichten der Haut, wobei sie einen Differenzierungsprozess durchlaufen. Wie in vielen Geweben, wird Ca2+ in seiner Eigenschaft als Second Messenger auch in diesem Zusammenhang eine wichtige Bedeutung zugemessen. Eine Reihe von Untersuchungen hat in der Vergangenheit gezeigt, dass jedoch nicht nur Calciumsignale, sondern auch die intra- und extrazellulären K+-Konzentrationen ein wichtiges Regulativ epidermaler Differenzierung darstellen. Darüber hinaus ist bekannt, dass 5-Adenosintriphosphat (ATP) einen Effekt auf die Keratinozytenbiologie hat. Die Bindung von ATP an seinen P2Y2-Rezeptor führt zur Phospholipase Cγ-abhängigen Generierung von Inositoltriphosphat (InsP3). InsP3 seinerseits führt zur Entleerung von Ca2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulums (ER) in das Zytosol. Die geringe Ca2+-Konzentration im ER aktiviert den „Store-Operated-Ca2+-Entry“. Vorarbeiten zeigten anhand von RNAse-Protection-Assays und elektrophysiologischen Messungen, dass HaCaT-Zellen, eine spontan immortalisierte Keratinozytenlinie, über den Ca2+-aktivierten intermediär leitenden K+-Kanal hIK1 verfügen. Paradoxerweise kam es nach verlängerter Inkubation (> 3 h) mit dem pharmakologischen Aktivator dieses Kanals 1‑EBIO zu einer Herunterregulation des hIK1. Dies hatte weitgreifende Auswirkungen auf die Biologie dieser Zellen: sowohl die Proliferationsrate als auch die Expression von Differenzierungsmarkern sanken. Zudem war die hIK1-vermittelte Hyperpolarisation, die sonst nach der Applikation von ATP zu messen war, nicht weiter nachweisbar. Auch der charakteristische Verlauf des Ca2+-Transienten nach ATP-Applikation war ohne den hIK1-Kanal deutlich verändert. In der vorliegenden Arbeit standen zwei Punkte im Vordergrund: Lassen sich mit der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie die verschiedenen Komponenten der ATP-induzierten Ca2+-Transienten darstellen? Aus welchen Kompartimenten wird das Ca2+ für den Transienten rekrutiert und inwieweit tragen hIK1 und andere Kanäle zum Anstieg der [Ca2+]i bei? Darüber hinaus interessierte, inwieweit durch die Langzeitapplikation des hIK1-Öffners 1‑EBIO, der zur paradoxen Herunterregulation des hIK1 führt, die Ca2+-Homöostase der Hautzellen beeinträchtigt. Kann dies die Langzeiteffekte von 1‑EBIO auf Proliferation und Differenzierung der HaCaT-Keratinozyten erklären? Hierfür wurden HaCaT-Keratinozyten mit den calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoffen Calcium Green‑1 und Fura Red beladen. Die mit einem konfokalen Laser-Scan-Mikroskop gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden zu einem Quotienten verrechnet und auf den Ruhewert normiert. Für die ATP-induzierten Transienten wurden Amplitude, t0,1-, t0,5- und die „Area under the curve” (AUC) bestimmt. Dieses ratiometrische Maß für [Ca2+]i nahm in Kontrollzellen einen charakteristischen Verlauf: mit Beginn der ATP-Applikation stieg [Ca2+]i stetig und direkt auf einen Maximalwert an, um dann innerhalb von durchschnittlich 21 min wieder auf den Ruhewert abzufallen. Das Absinken von [Ca2+]i auf den Ruhewert war durch zwei typische Schultern gekennzeichnet. Der Amplitude wie auch die AUC dieses Transienten waren dabei dosisabhängig, wobei bei geringen Werten für ATP eine Alles-oder-Nichts-Reaktion zu beobachten war. Um zu ermitteln, aus welchen Kompartimenten die Zelle das Ca2+ für den Transienten rekrutiert, wurde der Versuch in Ca2+-freier Badlösung sowie in Anwesenheit von ZnCl2 – einem Blocker für Ca2+-Influx – wiederholt. Während die Amplitude im Vergleich zur Kontrolle unverändert blieb, kehrte [Ca2+]i in beiden Fällen bereits in weniger als zwei Minuten wieder auf basale Werte zurück (8,5 % bzw. 9,5 % der Kontrolle). In einer zweiten Reihe von Experimenten untersuchten wir den Effekt des hIK1 auf Gestalt und Dauer des Ca2+-Transienten. In Zellen, in denen der hIK1-Kanal durch Langzeit-Inkubation mit 1‑EBIO (1 mM) herunter reguliert war, kehrte der Transient in weniger als sechs Minuten (26 % der Kontrolle) auf den Ruhewert zurück. Nun wurde der Versuch in Anwesenheit des selektiven hIK1-Blockers TRAM‑34 wiederholt. Der ATP-induzierte Ca2+-Transient unterschied sich in Verlauf und gemessenen Parametern nicht von dem der 1‑EBIO-behandelten Zellen. Um zu prüfen, ob es die hIK1-vermittelte Hyperpolarisation ist, die dem Transienten seine Form verleiht, wurde ATP bei hoher extrazellulärer Kaliumkonzentration appliziert. Wiederum war der Transient in der Dauer auf 34 % verkürzt, im Verlauf glich er wiederum dem Transienten in Zellen, deren hIK1-Aktivität pharmakologisch oder durch Herunterregulation geblockt war. Es ist bekannt, dass durch einfache Zugabe von 1‑EBIO (1 mM) die Membran von Hautzellen hyperpolarisiert. Unsere Experimente zeigten, dass ohne vorangehende Applikation von ATP [Ca2+]i lediglich leicht sinkt und für die Dauer der Perfusion mit 1‑EBIO einen stabilen Wert annahm. Möglicherweise werden durch das stärker negative Membranpotential [Ca2+]i-senkende Prozesse unterstützt, die während des ATP-induzierten Transienten maskiert sind. In der Zusammenschau der Befunde wird deutlich, dass sich das Ca2+ für der ersten Teil des Transienten nach der ATP-Applikation aus intrazellulären Kompartimenten rekrutiert. Der weitere Verlauf des Transienten ist abhängig vom Ca2+-Einstrom. In den Versuchen mit herunter reguliertem bzw. geblocktem hIK1-Kanal wurde zudem deutlich, dass es die hIK1-vermittelte Hyperpolarisation ist, die den Verlauf von [Ca2+]i entscheidend prägt. Die Verstärkung der treibenden Kraft unterstützt den Ca2+-Influx und zusätzlich eingeströmtes Ca2+ unterhält die Aktivierung des hIK1-Kanals im Sinne eines sich selbst erhaltenden Regelkreises. Der Umstand, dass durch die Anwesenheit intakter hIK1-Kanäle der Ca2+-Influx verstärkt und die Dauer von Calciumsignalen verlängert wird, ist eine mögliche Erklärung für die veränderte Biologie der 1‑EBIO behandelten Keratinozyten, wie sie zuvor beschrieben wurde. Die Ergebnisse aus dieser Arbeit geben zudem eine mögliche Erklärung für die Beobachtung verschiedener Autoren, nach denen nicht nur Ca2+, sondern auch K+ weitgreifende Bedeutung für die Biologie von Keratinozyten besitzt.

Quote

Citation style:

Bergmann, Philipp: Einfluss des humanen Intermediate Conductance K+-Channel hIK1 auf die Ca2+-Homöostase in menschlichen Keratinozyten.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export