Akkumulatiion von Vitamin E in C6-Rattengliomzellen und zytoprotektive Wirkung gegen oxidativen Stress

Müller, Agnes

ROS (reactive oxygen species) bzw. oxidativer Stress werden mit einer Vielzahl von Erkrankungen, wie beispielsweise der Atherosklerose oder neurodegenerativen Erkrankungen, aber auch mit dem physiologischen Alterungsprozess in Verbindung gebracht. Durch die additive Zugabe von Vitamin E bzw. α-Tocopherol, eines der bekanntesten Vertreter der Antioxidantien, wird ein schützender Effekt vor den oben genannten Erkrankungen vermutet, doch bisher gibt es sowohl in epidemiologischen Studien als auch in zahlreichen Zellkulturversuchen z. T. widersprüchliche Ergebnisse. In dieser Arbeit sollte daher geklärt werden, ob und inwieweit sich durch eine Vorbehandlung von kultivierten C6-Rattengliomzellen mit dem als Radikalfänger bekannten α-Tocopherol eine schützende Wirkung gegenüber einer oxidativen Schädigung durch Cumolhydroperoxid (CHP) erreichen lässt und ob diese schützende Wirkung von der extra- und intrazellulären Konzentration von α-Tocopherol abhängig ist. Die zytotoxische Wirkung von CHP wurde als Verlust von Zellprotein gemessen. Die zytoprotektive Wirkung von α-Tocopherol wurde als Aufhebung der zytotoxischen Wirkung bzw. Verminderung der zytotoxischen Potenz von CHP erfasst. Der α-Tocopherol-Gehalt in Seren, Medien und Zellen wurde mit Hilfe der HPLC bestimmt. α-Tocopherol zeigte bei gleichzeitiger Gabe während der Exposition mit CHP keinen Schutz vor der oxidativen Schädigung von CHP. Der EC50-Wert war gegenüber den Kontrollen mit 42,67 ± 16,17 µM (n = 3) zu 39 ± 10,54 µM (n = 3) nicht erhöht. Eine 48stündige Vorinkubation der C6-Zellen mit 50 µM α-Tocopherol hingegen hatte eine deutliche Erhöhung des EC50-Wertes auf 103,7 ± 33,47 µM (n = 3) zur Folge. Dies bedeutet eine durchschnittliche Steigerung des EC50-Wertes um den Faktor 2,6 und somit einen Schutz der Zellen vor der schädigenden Wirkung des CHP. Durch zusätzliche Gabe von α-Tocopherol während der Exposition mit CHP war keine weitere Erhöhung des EC50-Wertes zu beobachten. In den verwendeten Seren, Medien und den Zellkulturen war α-Tocopherol bereits ohne zusätzliche Gabe vorhanden. Foetales Rinderserum (FBS) enthielt Konzentrationen von 1,084 ± 0,303 nmol/ml (n = 3) und Pferdeserum (HS) 0,737 ± 0,081 nmol α-Tocopherol/ml (n = 3). Somit war im serumhaltigen Versuchskulturmedium mit 5 % FBS eine α-Tocopherol-Konzentration von 0,054 nmol/ml sowie im Erhaltungsmedium mit 2,5 % FBS und 15 % HS 0,138 nmol α-Tocopherol/ml vorhanden. Die Zellkulturen enthielten 0,169 ± 0,062 nmol α-Tocopherol/mg Zellprotein (n = 4), wenn sie im Erhaltungskulturmedium (2,5 % FBS und 15 % HS) kultiviert wurden. In Anwesenheit von 5 % FBS im Versuchsmedium enthielten die Zellkulturen nach 48 Stunden 0,106 nmol α-Tocopherol/mg Protein (n = 2), während sie in Abwesenheit von FBS einen α-Tocopherol-Gehalt von 0,138 ± 0,011 nmol/mg Protein (n = 3) aufwiesen. Die Anreicherung von α-Tocopherol in den C6-Zellen zeigte eine Zeitabhängigkeit. Nach 24 Stunden war die Akkumulation in die C6-Zellen nahezu abgeschlossen und der zelluläre α-Tocopherol-Gehalt erreichte sein Maximum. Überdies war eine deutliche Abhängigkeit der akkumulierten Menge an α-Tocopherol von der eingesetzten Konzentration im Medium zu beobachten. Eine 48stündige Vorinkubation mit der höchsten löslichen Konzentration von 50 µM α-Tocopherol bewirkte eine Erhöhung des intrazellulären α-Tocopherol-Gehaltes auf das 31fache (Serumfreies Versuchsmedium) bzw. auf mehr als das 300fache (Serumhaltiges Versuchsmedium). Die schützende Wirkung von α-Tocopherol war bereits bei geringen Konzentrationen von 2 µM im Medium zu beobachten. Das Ausmaß der zytoprotektiven Wirkung zeigte sich anhand einer Steigerung der EC50-Werte auf das Zwei- bis Vierfache im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen. Dieser schützende Effekt konnte durch Erhöhung der α-Tocopherol-Konzentrationen auf 10 bzw. 50 µM nicht wesentlich gesteigert werden (vgl. 3.3). Somit war die zytoprotektive Wirkung nicht proportional der im Medium vorhandenen Konzentration an α-Tocopherol, sondern zeigte im Gegensatz zum konzentrationsabhängigen intrazellulären α-Tocopherol-Gehalt einen „Sättigungseffekt“. Als mögliche Ursachen dieser Sättigung sind andere schädigende Mechanismen des CHP außer der Lipidperoxidation, das Fehlen von Tocopherolradikale reduzierende Co-Antioxidantien wie GSH und Ubichinon oder andere sättigbare genomische Wirkungen des α-Tocopherol zu nennen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse sind weitere Untersuchungen sinnvoll.

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Müller, Agnes: Akkumulatiion von Vitamin E in C6-Rattengliomzellen und zytoprotektive Wirkung gegen oxidativen Stress. 2009.

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