Charakterisierung der MUC-1-spezifischen zellulären Antwort bei Pankreaskarzinomen im Rahmer einer MUC-1 Peptidvakzinestudie

Mortazawi, Seyed Kiarasch

In dieser Dissertationsarbeit wurden Proben von insgesamt 12 Patienten mit einem periampullären oder duktalen Pankreasadenokarzinom aus einer Phase I/II Studie zur in vivo Immunisierung mittels einer synthetischen Vakzine aus einem tumorspezifischen repetitiven MUC-1 Polypeptid und dem Adjuvans SB-AS-2 untersucht. Das tumorspezifische MUC-1 Polypeptid enthielt eine fünffache Wiederholung (sog. tandem repeats) des tumorspezifischen, 20 Aminosäuren-langen Grundpeptids des Mucin-I-Glykoproteins. Es ist beschrieben, dass dieses Peptid nach Vakzinierung Einfluß auf das Immunsystem nimmt. Es kommt zu einer vermehrten T-Zellproliferation sowie zu einer vermehrten Sezernierung von Antikörpern und Zytokinen. Ziel dieser Arbeit war es, die spezifische zelluläre Antwort der Immunzellen auf das MUC-1 Polypeptid zu untersuchen. Hierfür erfolgte die Etablierung eines IFNγ-ELISPOT-Assays, mit dem die spezifische, gegen das Tumorantigen MUC-1 gerichtete T-Zellantwort analysiert werden sollte. Für IFNγ ist beschrieben, dass es mit der spezifischen, gegen den Tumor gerichteten Zytotoxizität korreliert. IFNγ kann sich als proinflammatorisches Zytokin positiv auf das Überleben der Patienten, auch beim Pankeaskarzinom, auswirken. Als Positivkontrolle zum Vergleich mit den Patientenproben wurden periphere Blutlymphozyten von einem gesunden Spender verwendet. In diesem Zusammenhang wurde die IFNγ-Sekretion nach unspezifischer (Stimulans PHA, 5μg/ml) bzw. spezifischer Stimulation (Stimulans MUC-1) gemessen und diese miteinander verglichen. Zusätzlich sollten eventuell im Zeitverlauf der Studie vorhandene quantitative Unterschiede in der Zytokinsekretion (IFNγ) sowie Proliferationseigenschaften herausgefunden werden. Zuletzt sollte der Einfluss der Lagerung, der Kryokonservierung und des Auftauens auf die Zytokinproduktion demonstriert werden. Bei der Etablierung des IFNγ-ELISPOT-Assays galt es drei Hauptfaktoren zu untersuchen: die optimale Stimulationsdauer, die Verwendung des Stimulans PHA versus PMA/Ionomycin und die Reihenfolge der Gabe von Stimulans und MUC-1 Polypeptid. Die Ergebnisse unserer Etablierungsversuche an Hand der quantitativen Messung von Zellwachstum und IFNγ- sezerniernden Zellen ergaben: 1. Die Stimulationsdauer wurde auf 48 Stunden festgelegt. 2. Als Stimulans diente PHA 5μg/ml. 3. Die Zellen wurden für 48 Stunden mit PHA stimuliert, danach das MUC-1 hinzugegeben. Bei den untersuchten Patientenproben konnte gezeigt werden, dass sowohl die unspezifische Stimulation als auch die spezifische Stimulation im Vergleich zur Negativkontrolle zu einem Anstieg der IFNγ-Sekretion führte (durch PHA um ca. 50%, durchMUC-1 um ca. 30%). Der Effekt der unspezifischen Stimulation der Patientenzellen war im Vergleich zu den Zellen des gesunden Probanden deutlich geringer (um den Faktor 3). Betrachtet man den Zeitverlauf der einzelnen Blutentnahmen, so lässt sich eine Tendenz in einer vermehrten IFNγ-Sekretion erkennen, auch hier war der Effekt durch PHA stärker ausgeprägt als durch MUC-1 (vgl. Abb. 2.1, Seite 47). Bei der Zellproliferationsmessung kam es zu einem signifikanten Anstieg des Zellwachstums zu allen Zeitpunkten durch die Zugabe von PHA versus unbehandelte Zellen. Der Effekt war auch hier bei den Pankreaskarzinompatienten gegenüber den Zellen des gesunden Probanden geringer ausgeprägt (um ca. 30%). Über den Zeitverlauf zeichnete sich eine Zunahme der Zellzahl von Beginn bis zum Ende der Blutentnahmezeitpunkte ab, sowohl für die unstimulierten als auch für die stimulierten Proben (vgl. Abb. 1.1, Seite 45). Die gesteigerte Wachstumsrate könnte darauf zurückgeführt werden, dass die Vakzinierungstherapie einen positiven Einfluss auf die Proliferationseigenschaften der Zellen ausgeübt hat. Dies bestätigten auch Ergebnisse anderer Studien. Insgesamt waren die gemessenen Spots, welche die IFNγ-sezernierenden Zellen widerspiegeln und die Zellzahlrate sehr niedrig. Dies kann mehrere Ursachen haben: zum einen die eingeschränkte Immunfunktion bei Pankreaskarzinompatienten, welche sich in dieser Arbeit in einer verminderten Zytokinproduktion gegenüber Gesunden zeigte; zum anderen wurde auch eine supprimierte T-Zellrate durch hohe MUC-1 Spiegel bei Überexpression von Karzinompatienten beschrieben. Auch nimmt die Kryokonservierung mit dem Einfrier-, Lagerungs- und Auftauprozeß einen Einfluß auf die Zellvitalität und Zytokinproduktion. Verschiedene Studien kamen hier zu unterschiedlichen Ergebnissen. Bei dieser Arbeit spiegelt sich jedoch der Einfluß in der Form wieder, dass die frischen, nicht kryokonservierten Zellen gegenüber den konservierten verstärkt Zytokine sezernierten. Faßt man nun die Zunahme der IFNγ-Sekretion durch MUC-1 und die gesteigerte Wachstumsrate über den Zeitverlauf der Blutentnahmezeitpunkte zusammen, kann in diesem Zusammenhang von einer positiven „Anti-Vakzine-T-Zell-Antwort“ gesprochen werden, da zwei wichtige Kriterien erfüllt werden konnten: die Anzahl der gemessenen Zellen war nach Vakzinierung angestiegen und die Zellen haben das Antigen klar erkannt und, wie in unserem Fall, mit einer gesteigerten Zytokinproduktion reagiert. Ob hierdurch eine Verlängerung des Überlebens möglich ist müssen zukünftige Studien zeigen.

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Mortazawi, Seyed: Charakterisierung der MUC-1-spezifischen zellulären Antwort bei Pankreaskarzinomen im Rahmer einer MUC-1 Peptidvakzinestudie. 2009.

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