Dissecting MT1-MMP induced signalling pathways

Eisenach, Patricia Alice

Membrane-type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP, MMP-14) is a zinc-dependent type-I transmembrane proteinase, which is known to play a key role in pericellular proteolysis, cell invasion and angiogenesis. Overexpression or conditional expression of MT1-MMP enhances tumour growth in in vivo mouse models and elevated MT1-MMP levels in human cancer cells correlate with a poor prognosis. Tumourigenic angiogenesis and growth has been reported to be at least partly driven by the MT1-MMP-mediated transcriptional activation of the angiogenic factor vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), which is dependent on the catalytic and intracellular domain (ICD) of MT1-MMP. There is increasing evidence that in addition to the catalytic activity of MT1-MMP, it is involved in the transcriptional regulation of various target genes. However, the molecular mechanism underlying this regulation has not been investigated in detail so far. In this thesis two novel and independent MT1-MMP mediated signalling pathways have been identified. Initially, MT1-MMP dependent regulation of VEGF-A transcription was shown to involve the activity of VEGF receptor 2 (VEGFR-2) as well as key kinases including Src, PI3 kinase, mTOR and Akt. Accordingly, the phosphorylation levels of Src, Akt and mTOR were significantly enhanced by MT1-MMP expression in vitro and co-localisation between MT1-MMP and these phospho-forms was observed. Using deletion and substitution mutants of the ICD and catalytic domain, new motifs regulating VEGF-A expression were defined. Co-immunoprecipitation and immunofluorescent analyses revealed a complex of MT1-MMP, VEGFR-2 and active Src, which was primarily located at the cell surface of MCF-7 cells. This expression pattern was also confirmed by immunostaining of human mammary carcinoma sections. The interaction between MT1-MMP and Src was shown to be dependent on the MT1-MMP ICD, whereas its interaction with VEGFR-2 is dependent on the hemopexin and transmembrane domains. VEGFR-2 signalling and its localisation at the cell surface were further shown to be highly dependent on the MT1-MMP hemopexin and transmembrane domains. These findings suggest the involvement of a VEGFR-2 induced PI3K/Akt pathway in MT1-MMP dependent transcriptional regulation of VEGF-A and further emphasise the non-proteolytic functions of MT1-MMP during tumourigenic angiogenesis. Another MT1-MMP dependent signalling pathway was identified, which involves the Src and Proteasome mediated proteolytic cleavage of MT1-MMP. This processing led to the release of the ICD and transcriptional activation in a reporter gene assay. Accordingly, immunostaining and immunoblotting revealed the MT1-MMP ICD within the nucleus of MCF-7 cells transfected with either full-length MT1-MMP or tagged MT1-MMP constructs, in MDA-MB-231 cells and in sections of human mammary carcinomas. A soluble tagged intracellular domain penetratin peptide was found to enrich in nuclear fractions of MCF-7 cells and to co-immunoprecipitate with RNA-Polymerase II in a potential transcription initiation complex. Interestingly, MT1-MMP was found to be ubiquitinated at its intracellular K581 and mutation of this residue ablated nuclear detection of the MT1-MMP ICD, suggesting a potential role for MT1-MMP ubiquitination in proteasomal ICD release and nuclear translocalisation. Taken together, two novel MT1-MMP dependent pathways were identified. These findings (i) show that MT1-MMP induces a PI3 Kinase/Akt dependent pathway leading to the transcriptional up-regulation of VEGF-A, (ii) demonstrate an MT1-MMP – VEGFR-2 – Src tri-molecular complex in breast cancer cells, (iii) reveal the requirement for MT1-MMP, in particular its hemopexin domain, in the sub-cellular localisation of VEGFR-2 and (iv) demonstrate for the first time that MT1-MMP is ubiquitinated and undergoes proteolytic processing leading to the release of the MT1-MMP ICD, which was found to co-immunoprecipitate with Polymerase II in the nuclei of MCF-7 cells. These observations strengthen the role of MT1-MMP as a key protein in tumour growth, angiogenesis and cell motility and further emphasise the function of its intracellular domain as well as the emerging field of non-catalytic functions of MT1-MMP.

Membrane-type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP, MMP-14) ist ein Zinkabhängiges Typ-I Transmembranprotein, das eine wichtige Rolle in der perizellulären Degradation, der Zellmigration und -invasion sowie der tumorigenen Angiogenese spielt. Endogene Expression bzw. Überexpression von MT1-MMP erhöht die Malignität der Zellen sowie das Wachstum und die Größe von Tumoren. MT1-MMP nimmt eine Schlüsselrolle in der malignen Progression durch die Induktion der Tumorangiogenese ein, die zumindest zum Teil auf die MT1-MMP vermittelte Expression des proangiogenetischen Faktors Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A)zurückzuführen ist. Es konnte gezeigt werden, dass diese MT1-MMP abhängige transkriptionelle Regulation sowohl von der extrazellulären katalytischen Domäne als auch von der intrazellulären Domäne (IZD) des Enzyms abhängt. Neben der Regulation der VEGF-A Expression verstärken sich Hinweise, dass MT1-MMP auch die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert und dass es in nicht-katalytisch vermittelten zellulären Prozessen involviert ist. Der molekulare Mechanismus der transkriptionellen Regulation durch MT1-MMP wurde bislang jedoch nur unzureichend aufgeklärt. Im Verlauf dieser Doktorarbeit wurden zwei neue, voneinander unabhängige MT1-MMP vermittelte Signaltransduktionswege identifiziert. Zunächst wurde gezeigt, dass die beschriebene MT1-MMP abhängige Hochregulierung der VEGF-A Expression von der Aktivität von VEGF Receptor-2 (VEGFR-2) sowie den Schlüsselkinasen Src, PI3 Kinase, mTOR und Akt abhängig ist. Die in diesem Signalweg beteiligten Kinasen zeigten zudem einen signifikanten Anstieg ihres Phosphorylierungsgrades in Abhängigkeit der MT1-MMP Expression in in vitro Zellkultursystemen. Mit Hilfe immunologischer Detektionsverfahren wurde MT1-MMP zudem in einem Komplex mit den aktiven Phosphorylierungsformen von Src und Akt gefunden. Durch den Einsatz von Substitutions- und Deletionsmutationen wurden zusätzlich neue Motive der MT1-MMP Aminosäurensequenz identifiziert, die die transkriptionelle Expression von VEGF-A kontrollieren. Zudem wurde die Formation eines Komplexes bestehend aus MT1-MMP, VEGFR-2 und Src an der Zelloberfläche von MCF-7 Zellen beobachtet, welcher für die Genexpression von VEGF-A notwendig ist. Die IZD von MT1-MMP wurde als MT1-MMP - Src Interaktionsdomäne identifiziert. Die extrazelluläre Hemopexin- und die Transmembrandomäne hingegen vermitteln bzw. regulieren sowohl die Interaktion zwischen MT1-MMP und VEGFR-2 als auch die Lokalisierung von VEGFR-2. Die nähere Charakterisierung dieses MT1-MMP abhängigen Signalweges, der zur Expression von VEGF-A führt, legt einen VEGFR-2 induzierten Transduktionsweg mit anschließender Aktivierung von PI3 Kinase, Akt und mTOR nahe und unterstreicht die nicht-katalytische Rolle von MT1-MMP im Zuge der Tumorangiogenese. In dieser Arbeit wurde ein weiterer MT1-MMP abhängiger Signalweg identifiziert und charakterisiert, der durch eine Src- und Proteasom-vermittelte proteolytische Spaltung von MT1-MMP induziert wird. Diese Prozessierung führt zur Abspaltung der IZD und zur transkriptionellen Aktivierung in einem Reportergen System. Dementsprechend wurde die MT1-MMP IZD mittels immunologischer Ansätze in Zellkernen von (i) MCF-7 Zellen, (ii)MDA-MB-231 Zellen und (iii) humanen Mammakarzinomen detektiert. Ein Biotinmarkiertes MT1-MMP IZD Peptid wurde in der nukleären Fraktion von MCF-7 Zellen nachgewiesen und ko-immunopräzipitierte mit RNA Polymerase II, was auf einen potentiellen Transkriptions-Initiations Komplex hinweist. Interessanterweise konnte nachgewiesen werden, dass die MT1-MMP IZD ubiquitiniert (K581) wird und dass eine Mutation dieser Aminosäure die nukleäre Lokalisierung der MT1-MMP IZD signifikant reduziert. Die post-translationale Ubiquitinierung bietet eine interessante Erklärung für sowohl die Proteasom-abhängige Abspaltung als auch die nukleäre Translokalisierung der MT1-MMP IZD. Zusammenfassend wurden im Zuge dieser Arbeit zwei MT1-MMP abhängige Signaltransduktionswege identifiziert. Die hier zusammengefassten Daten zeigen, dass (i) VEGF-A Expression durch eine MT1-MMP vermittelte Aktivierung des PI3 Kinase/Akt Signalwegs induziert wird, (ii) MT1-MMP einen trimolekularen Komplex mit VEGFR-2 und Src an der Zelloberfläche bildet, (iii) MT1-MMP die zelluläre Lokalisierung und Kompartimentalisierung von VEGFR-2 steuert, (iv) die MT1-MMP IZD post-translational ubiquitiniert wird und dass (v) die MT1-MMP IZD abgespalten wird und im Nukleus von MCF-7 Zellen mit RNA-Polymerase II ko-immunopräzipitiert. Die hier dargestellten Ergebnisse heben die Rolle von MT1-MMP, insbesondere der intrazellulären Domäne, in der Tumorigenese hervor und fügen dem bereits umfassenden tumorigenen Funktionsspektrum von MT1-MMP neue nicht-katalytische Aktivitäten in der Biologie transformierter Zellen hinzu.

Quote

Citation style:

Eisenach, Patricia Alice: Dissecting MT1-MMP induced signalling pathways.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export