Seamless manipulation of the varicella-zoster virus genome via bacterial artificial chromosome engineering

Wussow, Felix

The human alphaherpesvirus varicella-zoster virus (VZV) causes chickenpox during primary infection and shingles upon reactivation from its latent state in sensory ganglia. Shingles are often associated with severe pain that can persist as postherpetic neuralgia. In order to facilitate the investigation of VZV, we constructed the genomes of the VZV strains P-Oka and HJO as infectious F-factor-derived bacterial artificial chromosomes (BACs). These two VZV BACs (pP-Oka and pHJO) can be seamlessly manipulated by versatile recombination techniques in Escherichia coli and subsequently delivered into VZV-permissive eukaryotic cells to allow the reconstitution of infectious mutant virus. In this work, the two different VZV BACs were engineered in E. coli to induce the seamless removal of the bacterial mini-F sequences upon virus reconstitution in VZV-permissive cells via novel replication-based strategies. In pP-Oka-derived virus, the mini-F sequences were efficiently released by homologous recombination of a stabilized inverse genomic duplication inserted into the bacterial vector elements. In contrast, this system was ineffective in virus progeny recovered from pHJO. To increase the efficiency of the vector elimination upon virus reconstitution from the cloned HJO genome, the mini-F sequences were precisely and seamlessly transposed within the viral DNA via a novel synchronous Red-recombination reaction in E. coli, whereby six different BAC variants were generated. The insertion of the mini-F sequences directly between the genomic termini resulted in a BAC derivate, of which the vector elements were autonomously and efficiently released during the virus recon¬stitution even without a genomic duplication. In addition, the derived progeny exhibited genome properties and replication kinetics virtually identical to that of the wild-type virus. In conclusion, the pP-Oka BAC with an inverse genomic duplication and the BAC variant of pHJO with terminal integrated mini-F vector are two optimized constructs to rapidly generate VZV mutants without leaving behind any operational sequences. Moreover, the mini-F vector transposition reaction eliminates the last hurdle to perform virtually any kind of imaginable targeted and seamless BAC modifications in E. coli. Thus, the newly developed manipulation techniques can be useful to optimize, repair, or restructure other established BACs as well, not even for the specific research field of herpesviruses, which may facilitate the development of gene therapy and vaccine vectors.

Das menschliche Alphaherpesvirus Varicella-Zoster-Virus (VZV) verursacht Windpocken bei der Primärinfektion und Gürtelrose bei der Reaktivierung aus der Latenz in sensorischen Ganglien. Die Gürtelrose ist häufig mit schweren Schmerzen verbunden, die als postherpeti-sche Neuralgie persistieren können. Um die Erforschung von VZV zu erleichtern, klonierten wir die Genome der VZV-Stämme P-Oka und HJO als infektiöse, F-Plasmid-abgeleitete bakterielle artifizielle Chromosomen (BACs). Diese beiden VZV-BACs (pP-Oka und pHJO) können durch vielseitig anwendbare Rekombinationstechniken in Escherichia coli nahtlos manipuliert und anschließend in VZV-permissive eukaryote Zellen transfiziert werden, um die Rekonstitution von infektiösen Virusmutanten zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurden die beiden unterschiedlichen VZV-BACs in E. coli verändert, um die nahtlose Entfernung der bakteriellen Mini-F-Sequenzen nach der Virusrekonstitution durch neuartige Replikationsstrategien zu induzieren. Bei aus pP-Oka hergestelltem Virus wurden die Mini-F-Elemente durch homologe Rekombination einer inversen stabilisierten geno-mischen Duplikation im bakteriellen Vektoranteil effizient entfernt. Im Gegensatz dazu war dieses System in Viren hergestellt aus pHJO ineffektive. Um die Effizienz der Vektor-elimination nach der Virusrekonstitution aus dem klonierten HJO-Genom zu verstärken, wurden die Mini-F-Sequenzen durch eine neuartige, synchrone Red-Rekombinationsreaktion in E. coli innerhalb der viralen DNA transponiert, wodurch sechs verschiedene BAC-Varianten konstruiert wurden. Die Insertion der Mini-F-Sequenzen direkt zwischen die Genomenden resultierte in einer BAC-Variante, von der die Vektorsequenzen autonom und effizient nach der Virusrekonstitution entfernt wurden, auch ohne genomische Duplikation. Zudem zeigten die hergestellten Viren Genomeigenschaften und Replikationskinetiken, die mit denen vom Wildtyp-Virus identisch waren. Der pP-Oka BAC mit inverser genomischer Duplikation und die BAC-Variante von pHJO mit terminal integriertem Mini-F-Vektor sind somit zwei optimierte Konstrukte zur schnellen Herstellung von Virusmutanten, ohne irgendwelche Fremdsequenzen zu hinterlassen. Zudem eliminiert die Mini-F-Transpositionsreaktion die letzte Hürde um jede vorstellbare, nahtlose BAC-Modifikation in E. coli durchzuführen. Die neuentwickelten Manipulationstechniken können somit nützlich sein um auch andere etablierte BACs zu optimieren, reparieren oder restrukturieren, nicht nur für das spezielle Forschungsgebiet der Herpesviren, was die Ent-wicklung von Gentherapie- oder Impfstoffvektoren erleichtern könnte.

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Wussow, Felix: Seamless manipulation of the varicella-zoster virus genome via bacterial artificial chromosome engineering. 2009.

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