Experimentelle Untersuchungen zur Bedeutung von Wachstums- und Gerinnungsfaktoren bei der Entstehung maligner Ergüsse

Blume, Lars-Fabian

Etwa 15-20 % aller Tumorpatienten entwickeln im Verlauf ihrer Erkrankung einen pleuralen oder peritonealen Erguss. In Anbetracht der kurzen Überlebenszeit von im Mittel 20 Wochen ist bei der Therapie maligner Ergüsse die Beseitigung der durch den Erguss hervorgerufenen Symptome und Beschwerden das zentrale Ziel. Bisher gibt es keine befriedigende Behandlung maligner Ergüsse, da nur eine begrenzte Patientenzahl körperlich in der Lage ist, sich einem invasivem Eingriff mit abschließender Pleurodese zu unterziehen. Andererseits treten nach Punktion häufig Rezidive auf. In der vorliegenden Arbeit wurden Studien zu der Bedeutung von VEGF, in dessen Funktion als Permeabilitätsfaktor, bei der Entstehung maligner Ergüsse durchgeführt. Ziel der Studien war es, die Option einer Anti-VEGF-Therapie mit dem gegen VEGF neutralisierend wirkenden Antikörper Bevacizumab zur Behandlung maligner Ergüsse präklinisch zu untersuchen. Mit der Bestimmung der Permeabilität markierter löslicher Verbindungen und der Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) wurden zwei literaturbekannte Verfahren herangezogen, um epitheliale Permeabilitätsveränderungen zu quantifizieren. Da der experimen-telle Aufbau TEER-Messungen bei unterschiedlichen Temperaturen erforderte, musste die aus der Literatur bekannte Temperaturabhängigkeit der TEER-Messung berücksichtigt werden. Dazu wurde erstmalig eine mathematische Lösung erarbeitet, mit der temperaturunabhängige TEER-Werte unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erhalten werden können. Um möglichst in vivo Bedingungen zu simulieren, wären die VEGF-vermittelten Permeabilitätsveränderungen idealerweise an der Pleura parietalis untersucht worden. Daher wurde die Pleura parietalis vom Schwein in eine im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Apparatur eingespannt. Da die Studien an der Pleura jedoch zu wenig reproduzierbaren Ergebnissen führten, wurde mit dem Caco-2 Monolayer ein Zellkultur basiertes Modell etabliert. Aus der Literatur sind drei VEGF-Rezeptoren bekannt. Die Bedeutung des VEGF-R2 für VEGF-vermittelte Permeabilitätsänderungen konnte mittels VEGF-R2-spezifischer siRNA oder Rezeptor-Antagonisten auch für Caco-2 Monolayer gezeigt werden. In früheren Studien wurde bereits im Tiermodell die Option einer intrakavitären Bevacizumab-Therapie mit dem Ziel, die VEGF-vermittelte Hyperpermeabilisierung und damit die Ergussentstehung zu hemmen, untersucht. Da die Zulassung von Bevacizumab die Therapie maligner Ergüsse bisher nicht umfasst, sind auch keine Empfehlungen für eine Dosierung bei dieser Indikation gegeben worden. In der vorliegenden Arbeit konnte am Modell des Caco-2 Monolayers für Bevacizumab eine Dosis-Wirkungskurve gezeigt werden. Die maximale Verminderung der Permeabilität wurde für eine Bevacizumab-Konzentration von 2,53 mg/ml nachgewiesen. Eine ED50 von 0,7 mg/ml wurde berechnet. Da die aus der ED50 resultierenden hohen Antikörper-Konzentrationen die nach bisher empfohlenen Dosierung resultierenden Plasmaspiegel deutlich überschreiten, stellte sich die Frage nach der Applikationsart. Die erstmalig an Caco-2 Monolayern durchgeführten Permeabilitäts-studien zeigten eine schlechte Permeabilität von Bevacizumab. Die Ergebnisse legen eine intrakavitäre Applikation nahe, da sie auf eine nur minimale Permeabilität vom Plasma in den Erguss hinweisen. Die intrakavitäre Applikation scheint aber auch vor dem Hintergrund sinnvoll, dass epidemiologische Studien in dieser und in früheren Arbeiten gezeigt haben, dass die VEGF-Konzentration gerade im Erguss deutlich erhöht ist. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass aus Ergüssen isolierte Zellen VEGF freisetzen können und somit direkt kausal für hohe VEGF-Spiegel in malignen Ergüssen sein können. Zur Aufklärung der Expression und Freisetzung von VEGF durch isolierte Primärzellen, wurden in den Ergüssen befindliche mögliche Stimulanzien der VEGF-Expression quantifiziert. Anschließend wurden sowohl die aus dem Erguss isolierten Zellen als auch verschiedene Zell-linien mit den Gerinnungsfaktoren FIIa und FXa sowie dem Chemokin IL-8 und dem Wachstums-faktor TGF-ß1 behandelt. Es zeigte sich, dass TGF-ß1 sowohl die VEGF-mRNA als auch die VEGF-Freisetzung am stärksten induziert. Daneben konnte lediglich für FIIa eine signifikante Steigerung der VEGF-Freisetzung nachgewiesen werden. Der PAR-2-Agonist, der anstelle von FXa eingesetzt wurde, zeigt nur eine schwache Induktion und IL-8 blieb ohne Wirkung auf die VEGF-Expression. Die Tendenz der Ergebnisse war bei allen untersuchten Zellen vergleichbar. Unterschiede konnten lediglich im Unfang der Effekte belegt werden. Untersuchungen inwieweit FIIa, FXa, IL-8 und TGF-ß1 in Konzentrationen, in denen sie auch in den Ergüssen nachweisbar waren, die Permeabilität des Caco-2 Monolayers beeinflussen können, ergaben lediglich für TGF-ß1 signifikante Effekte. Ein Anstieg der Permeabilität um gemittelte 20 % war nachweisbar. Inwieweit diese Effekte VEGF-abhängig sind, wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Erste Experimente deuten allerdings darauf hin, dass zunächst ein VEGF-unabhängiger Effekt für die Hyperpermeabilisierung verantwortlich ist, bevor dieser von einer VEGF-abhängigen Komponente abgelöst wird.

Approximately 15-20 % of tumor patients develop pleural or peritoneal effusions during the progression of their disease. Considering the short mean survival time of 20 weeks, the foremost goal in the therapy of malignant effusions is the palliation of the symptomatic patient. Until now, there is no satisfactory treatment of malignant effusions, as only a limited number of patients is able to undergo invasive surgery with chemical pleurodesis. Further, thoracentesis or paracentesis often result in relapse. Here we set out to research the significance of VEGF in its function as a permeability factor in the formation of malignant effusions. Examining the therapeutic efficacy of an anti-VEGF therapy with Bevacizumab in the setting of malignant effusions preclinical studies were performed. Two different methods were applied to determine the epithelial permeability changes. Firstly the direct measurement of the permeability of marked solute and secondly the determination of the transepithelial electrical resistance (TEER) was used. As the experimental set-up required TEER measurements at different temperatures, the influence of temperature on TEER values as known from the literature had to be considered. For this purpose, a new mathematical solution was worked out, with which the temperature-independent TEER values can be calculated under different experimental conditions. To mimic physiological conditions permeability changes caused by VEGF would have been ideally investigated at the pleura parietalis. Therefore, porcine pleura parietalis was fixed in an apparatus which was designed for this work. However, difficulties during the studies occurred, as for example the limited availability and complex preparation of the pleura parietalis, leading to not reproducible results. Therefore a cell culture model based on Caco-2 monolayer was established. In recent studies the option of an intracavitary therapy with Bevacizumab was investigated, using an animal model in order to inhibit the VEGF-induced permeability and therefore the formation of the effusion. As the current drug approval of Bevacizumab does not content the therapy of malignant effusions, there are no dosage recommendations given. In this work a dose-response relationship for Bevacizumab is shown for Caco-2 monolayer. The maximum reduction of the permeability was shown at a Bevacizumab concentration of 2,53 mg/ml. An ED50 of 0,7 mg/ml was calculated. As the determined high antibody concentrations exceeded clearly the plasma levels due to the present dosage recommendation, the most beneficial kind of application had to be established. Permeability studies initially made on Caco-2 monolayer have shown a poor permeability of Bevacizumab. Therefore a intracavitary application of Bevacizumab would be most suitable for a optimal inactivation of VEGF. Also considering the fact, that epidemiological studies had shown that the VEGF concentration is increased especially in effusions, intracavitary application seems to be appropriate. It was shown that cells isolated from effusions are able to secrete VEGF and therefore they are directly responsible for high VEGF levels in malignant effusions. To explain the high VEGF concentrations, factors from the effusion that were able to induce the VEGF expression were quantified. Afterwards cells isolated from the effusions as well as different cell lines were incubated with the coagulation factors FIIa and FXa same as chemokine IL-8 and further the growth factor TGF-ß1. It became obvious that the impact of TGF-ß1 on both, the VEGF-mRNA as also the VEGF secretion is the highest of all factors mentioned before. Besides the effect of TGF-ß1 only a significant increase of the VEGF secretion could be proved for FIIa. The PAR-2-Agonist that was used instead of FXa shows only a poor induction and IL-8 remained without effect on the VEGF expression. The tendency of the results was comparable for all investigated cells. Differences could be detected only in the extent of the effects. Studies of the impact of FIIA, FXa, IL-8 and TGF-ß1 on the permeability of the Caco-2 monolayer in concentrations, in which they also were detectable in effusions, yield merely for TGF-ß1 in significant results. A mean increase of the permeability of 20 % was shown. To what extent these effects depend on VEGF has to be investigated in further studies. Initial experiments indicate that at first a VEGF-independent effect is responsible for the increased permeability, afterwards a VEGF-dependent component takes place instead of it. Summing up the results of this work a model regarding the formation of malignant effusions is presented from which possible therapeutic options can be deviated.

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Blume, Lars-Fabian: Experimentelle Untersuchungen zur Bedeutung von Wachstums- und Gerinnungsfaktoren bei der Entstehung maligner Ergüsse.

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