Genotypisierung und Resistenzbestimmung des Hepatitis-B-Virus durch Pyrosequenzierung

Zimmermann, geb. Rybarkiewicz, Paul Leszek

Die Hepatitis B ist mit weltweit 320-400 Millionen chronisch-aktiv infizierten Menschen die häufigste Viruserkrankung. Die chronische HBV-Infektion kann zur Leberzirrhose und zum hepatozellulären Karzinom führen. Durch eine Therapie chronisch infizierter Patienten mit IFN-α sowie den Nukleosidanaloga Lamivudin, Adefovir-Dipivoxil oder Entecavir soll die Virusreplikation blockiert und damit die Häufigkeit der Spätfolgen reduziert werden. Die Kenntnis des HBV-Genotyps sowie bekannter Resistenz-Mutationen des Virusgenoms spielt eine große Rolle für eine erfolgreiche antivirale Therapie. Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Routinediagnostik-Methode für die gleichzeitige Genotypisierung und Resistenzbestimmung von HBV zu etablie-ren. Dabei sollte die Technik der Pyrosequenzierung zum Einsatz kommen. Diese ermöglicht die Sequenzierung von kurzen Abschnitten von bis zu 100 Basenpaaren in Echtzeit und ist eine preisgünstige Alternative zur Sanger-Sequenzierung. Bei insgesamt 53 Patientenproben wurde ein Abschnitt der HBV-DNA-Polymerase durch Pyrosequenzierung und Sanger-Sequenzierung analysiert. Daraufhin wurden die Patientenproben genotypisiert und auf die bekannten Mutationen der Polymerase für Lamivudin- (rtM204V/I) und für Adefovir-Resistenz (rtA181V/T, rtN236T) sowie den kompensatorischen Mutationen für die Virus-Fitness (rtV173L, rtL180M) hin untersucht. Die Ergebnisse beider Methoden waren identisch. Parallel wurde eine Datenbank aus ca. 500 publizierten HBV-Sequenzen, vorrangig der Genotypen A und D, aufgebaut und mit dem NCBI-Algorithmus klassifiziert. Diese Datenbank diente der Auswertung der Sequenzen aus den Patientenproben. Die Pyrosequenzierung war also für die Bestimmung des Genotyps und der Resistenz-Mutationen genauso sensitiv wie die Sanger-Sequenzierung. Die Methode wurde schließlich im QCMD-Ringversuch validiert und steht der Routinediagnostik zur Verfügung.

Hepatitis B is with worldwide 320-400 million chronically and actively infected people the most common viral disease. The chronic HBV infection can lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The therapy of chronically infected patients with IFN-α and the nucleoside analogues Lamivudine, Adefovir dipivoxil or Entecavir aims at blocking viral replication and reducing the rate of late complications. The knowledge of the HBV genotype and of defined resistance mutations in the viral genome plays a major role for the successful antiviral therapy. This project aimed at establishing a new method for routine diagnostics for the genotyping and determination of HBV resistance in parallel. The technique of pyrosequencing should be applied. This technique allows the sequencing of short segments of up to 100 base pairs in real time and is a low priced alternative to Sanger sequencing. In a total of 53 patient samples a region of the HBV DNA polymerase was analyzed by pyrosequencing and Sanger sequencing. Subsequently, the patient samples were genotyped and investigated for the defined major mutations of the polymerase for resistance to lamivudine (rtM204V/I) and adefovir (rtA181V/T, rtN236T) and compen-satory mutations for viral fitness (rtV173L, rtL180M). The results of both methods were identical. In parallel, a database of approximately 500 published HBV sequen-ces of mainly genotypes A and D was established and classified with the NCBI algorithm. This database was used to evaluate the sequences from the patient samples. Thus, pyrosequencing was as sensitive as Sanger sequencing for the determination of the genotype and of the resistance mutations. Finally, the method was validated in the QCMD external quality assessment test and is now available in the routine diagnostic.

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Zimmermann, geb. Rybarkiewicz, Paul Leszek: Genotypisierung und Resistenzbestimmung des Hepatitis-B-Virus durch Pyrosequenzierung.

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