Transport- und Biotransformationsstudien mit Amidinprodrugs

Schwering, Ulrike

In der Entwicklung oral verfügbarer Arzneistoffe werden Prodrug-Prinzipien angewendet, um hydrophile Verbindungen in eine lipophile Transportform zu überführen, welche dann eine verbesserte orale Bioverfügbarkeit aufweisen. Pentamidin wird zur Prophylaxe und Therapie der Afrikanischen Schlafkrankheit eingesetzt. Die hohe Basizität und die damit einhergehende Protonierung unter physiologischen Bedingungen verhindern die Diffusion durch die Membranen des Gastrointestinaltrakts. Auf der Suche nach einem oral verfügbaren Prodrug des Pentamidins wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene dieser Verbindungen im Caco-2 Modell untersucht. Prodrugs müssen nach der Absorption durch körpereigene Enzymsysteme in die eigentliche Wirkform überführt werden. N hydroxylierte Verbindungen werden als Prodrugs für Amidine, wie beispielsweise dem Diamidoxim des Pentamidins, eingesetzt. An der Reduktion zum entsprechenden Amidin ist das 2006 entdeckte Enzym mARC beteiligt. Um die Tauglichkeit von Zellkultursystemen für Prodrugstudien zu belegen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Caco-2 und HEK-293 Zellen auf die Expression von mARC untersucht. Beide Zellkulturmodelle zeigten eine mit primären, porcinen Hepatozyten vergleichbare Reduktaseaktivität der Modellverbindung Benzamidoxim zum Benzamidin. Außerdem konnte mARC 2 mit Hilfe von Westernblot und ELISA in den beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Neben den Zellininen wurde eine Quantifizierung von mARC in weiteren primären Zellkulturen (Hepatozyten, Schilddrüsenfollikeln, Blut) vorgenommen, dabei wurde eine ungewöhnlich hohe Expression von mARC 2 in der Schilddrüse gefunden. Hinweise auf eine Beteiligung von mARC an den metabolischen Prozessen der Schilddrüse lieferten die Studien an verschiedenen humanen und murinen Schilddrüsenzelllinien, die unter TSH-Stimulation eine um den Faktor drei dezimierte Reduktaseaktivität aufwiesen. Weiterhin konnte an porcinen Lebermitochondrien gezeigt werden, dass das Thyreostatikum Thiamazol vom Typ der Thioharnstoffe die Benzamidoximreduktaseaktivität mit einem EC50-Wert von 270 µM inhibiert.

Prodrug principles are widely used in the development of oral drugs, especially when a hydrophilic compound needs to be converted to a lipophilic transportform. The oral bioavailability of the prodrug should be highly increased in comparison to the parent drug. Pentamidine is used for the prophylaxis and therapy of the African Trypanosomiasis. Due to the pKa of 11.4, pentamidine is protonated under physiological conditions and cannot be absorbed by diffusion in the gastrointestinal tract. In this study, the permeability of several prodrugs of pentamidine was determined by using the Caco-2 cell model. After absorption, prodrugs need to be converted to the active principle. This conversion is mainly catalysed by enzyme systems. N-hydroxylated compounds are used as prodrugs for amidines (e.g. diamidoxime is used as prodrug for pentamidine). The recently identified enzyme mARC participates in the N-reduction of amidoximes. To prove the suitability of widely used cell lines for in vitro amidoxime prodrug studies, the expression of mARC was studied in Caco-2 cells and HEK-293 cells. Both cell lines showed similar benzamidoxime reductase activity as primary cultured porcine hepatocytes. Furthermore, the expression of mARC 2 was shown by westernblot and ELISA analysis. Among the cell lines, mARC was quantified in different primary cultured tissues. An unexpectedly high mARC 2 expression was found in the thyroid gland. A participation of mARC at the metabolic processes within the thyroid was suggested by the decrease in reduction of benzamidoxime reductase activity under TSH stimulation by factor three, which was investigated in different human and rhodent thyroid cell lines, each cultured with and without TSH stimulation. Additionally, studies with the thyroid therapeutic agent thiamazol carried out with porcine liver mitochondria showed a decrease in benzamidoxime reductase activity with an estimated EC50 of 270 µM.

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Schwering, Ulrike: Transport- und Biotransformationsstudien mit Amidinprodrugs.

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