Mastzellen und Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) : Expression funktioneller PAR durch primäre humane Mastzellen und Einfluss des PAR-Liganden Thrombin auf die FceRI-vermittelte Degranulationsreaktion

Ghulam, Oranos

Mastzellen spielen ein wichtige Rolle in der akuten allergischen Reaktion. Sie sind die Hauptakteure während dieser Reaktion. Aktivierung von FcRI-induzierten Signalwegen über Kreuzvernetzung von oberflächengebundenem IgE durch Antigen oder Allergen führt dabei zur überschießenden Degranulationsreaktion dieser Zellen, die für die typischen allergischen Symptome wie Niesen, Husten und Juckreiz verantwortlich ist. Durch Untersuchungen in Mäusen ist bekannt, dass Mastzellen auch über Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) aktiviert werden können, einen IgE-unabhängigen Mechanismus. Wenig ist jedoch über die Expression und Funktion dieser neuen Familie G-Protein-gekoppleten Rezeptoren bei humanen Mastzellen bekannt. Daher war es Ziel meiner Untersuchungen zu klären, ob und welche PAR (PAR1, -2, -3, oder -4) von primären humanen Mastzellen aus der Lunge und aus der Haut exprimiert werden und ob diese Rezeptoren auch eine Rolle in der Regulation der Mastzelldegranulation spielen. Mittels qualitativer und quantitativer PCR-Methoden konnte ich nachweisen, dass isolierte humane Lungen- und Hautmastzellen konstitutiv mRNA für alle PAR-Typen exprimieren. Demgegenüber führte der immunzytochemische Nachweis mittels PAR-spezifischer Antikörper lediglich zur Detektion der Zelloberflächenexpression der Rezeptorproteine für PAR1 und PAR4. Obwohl PAR2 per Duchflusszytometrie nur intrazellulär nachweisbar war, liess sich die Oberflächenexpression und zudem die Funktionalität dieses Rezeptors nach Stimulation von Mastzellen mit PAR2-AP, einem synthetischen rezeptorspezifischen PAR-aktivierenden Peptid, anhand der Induktion eines intrazellulären Ca-Signals und einer (schwachen) Degranulationsreaktion demonstrieren. Die Induktion von Mastzelldegranulation durch die PAR-aktivierenden Peptide PAR1-AP und PAR4-AP sowie die Mobilisierung von intrazellulären Kalziumionen erwiesen die Funktionalität auch von mastzellexprimiertem PAR1 und PAR4. Ganz unerwartet, im Widerspruch zu Ergebnissen im Maussystem stehend, war keine der neun als physiologische PAR-Liganden bekannten Proteinasen in der Lage Mastzelldegranulation zu induzieren, und nur zwei dieser Enzyme Thrombin (PAR1-/PAR4-Ligand) und Trypsin (PAR2-Ligand) induzierten ein Ca-Signal. Interessanterweise führte Vorinkubation humaner Mastzellen mit Thrombin oder Trypsin jedoch zu einer drastischen Inhibition der FcRI-vermittelten Degranulation und liess daher eine gegenregulatorische Rolle von Proteinasen, bzw. von PAR, bei der Mastzellaktivierung vermuten. Weiterhin mit Thrombin durchgeführte Experimente zeigten, dass eine 5-minütige Vorinkubation mit einer physiologischen Konzentration des Enzyms für maximale Inhibition der Degranulation ausreichend war, und der inhibitorische Effekt eine gewisse Selektivität für die über den FcRI vermittelte Degranulation aufwies. Wie Versuche zur selektiven Inhibition der enzymatischen Aktivität des Thrombins durch PMSF und Hirudin zeigten, war die katalytische Aktivität des Enzyms, und damit möglicherweise auch die Aktivierung von PAR, essentiell für dessen inhibitorische Wirkung. Tatsächlich konnte Vorinkubation von Mastzellen mit nicht stimulatorischen Konzentrationen an PAR1-AP und PAR4-AP den inhibitorischen Effekt von Thrombin simulieren, und gleichzeitige funktionelle Blockierung von PAR1 und PAR4 durch rezeptorspezifische membranpermeable Pepduzine hoben die durch Thrombin vermittelte Inhibition der Mastzelldegranulation vollständig auf. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Aktivierung von PAR1 und PAR4 durch Thrombin auf humanen primären Mastzellen die FcRI-induzierte Mastzelldegranulation kontrolliert. Damit scheinen auf Mastzellen exprimierte PAR im humanen System eine andere Funktion zu erfüllen als im murinen System. Aufgrund ihrer möglichen Funktion als negative Regulatoren mastzellabhängiger entzündlicher, insbesondere allergischer Prozesse, könnten sie Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten für mastzellabhängige allergische Reaktionen darstellen.

Mast cells play a pivotal role during acute allergic reactions. Crosslinking of surface-bound (i.e. FcRI-bound) IgE molecules by antigen or allergen leads to mast cell degranulation, thereby stimulating the release of a variety of mediators which then cause the typical allergic symptoms such as sneezing, itching and coughing. Current investigations in mice revealed the activation of mast cells via proteinase-activated receptors (PAR), i.e. in an IgE-independent manner. However, still little is known about the expression and function of this novel family of G protein-coupled receptors on primary mast cells of human origin. Therefore the aim of this study was to investigate what types of PAR (PAR1, -2, -3, or -4) are present on human primary mast cells isolated from lung and skin and whether these receptors might be involved in regulating mast cell degranulation. Using qualitative as well as quantitative PCR-methods I could show that human primary mast cells constitutively express mRNA for all four types of PAR, whereas immunostaining with PAR-specific antibodies detected cell surface expression of receptor protein only for PAR1 and PAR4. Although PAR2 was detectable by flow cytometry only intracellularly, stimulation of mast cells by synthetic receptor-specific PAR-activating peptides (PAR-AP) revealed the surface expression of PAR2 as well as its functionality, as demonstrated by the ability of PAR2-AP to induce an intracellular Ca-signal and a (slight) degranulation response. Likewise, PAR1 and PAR4 proved to be functional, as mast cells responded to PAR1- and PAR4-AP by Ca-signals and vigorous degranulation. Unexpectedly, as contradictive to previous observations in mice, none out of nine proteinases known to represent physiological PAR-ligands induced mast cell degranulation, and only two them, thrombin (a PAR1/PAR4-ligand) and trypsin (a PAR2-ligand) induced intracellular Ca-release. Interestingly, preincubation of mast cells with these two latter enzymes drastically inhibited FcRI-dependent degranulation, suggesting a counter-regulatory role for proteinases and PAR in mast cell activation. Choosing thrombin for further investigation, it turned out that preincubation of cells with a physiological concentration of the enzyme for 5 min was sufficient to obtain maximal inhibition and that the inhibitory effect was selective for FcRI-induced degranulation, but not other stimuli such as LL 37 and substance P. Inhibitors of thrombin enzymatic activity (PMSF, hirudin) completely abolished its inhibitory impact, demonstrating that catalytic enzyme activity, and thus possibly PAR-activation is required. In fact, preincubation of mast cells with non-stimulating dosages of PAR1- and PAR4-AP in combination mimicked thrombins’ inhibitory effect on FcRI-induced degranulation, while simultaneous blockade of PAR1- and PAR4-signalling by application of receptor-specific membrane permeable pepducins completely abrogated thrombins’ inhibitory effect. Taken together these results demonstrate that combined activation of PAR1 and PAR4 by thrombin in human primary mast cells controls FcRI-induced mast cell degranulation. Thus, mast cell-expressed PARs in the human system appear to have acquired a role quite different from that in the murine system. Although further investigation is needed to explore the physiological relevance of these findings, they may perhaps provide a basis for the development of anti-allergic strategies in the future.

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Ghulam, Oranos: Mastzellen und Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) : Expression funktioneller PAR durch primäre humane Mastzellen und Einfluss des PAR-Liganden Thrombin auf die FceRI-vermittelte Degranulationsreaktion.

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