The role of HP1β on genomic stability and cellular senescence

Billur, Mustafa

Heterochromatin protein 1 (HP1) proteins are fundamental units of heterochromatin packaging that are enriched at the centromeres and telomeres of nearly all eukaryotic chromosomes. HP1 homologues are found in a variety of organisms and are involved in the establishment and maintenance of higher-order chromatin structures by specifically recognizing and binding to (tri- and di-) methylated lysine 9 on histone H3. In mammals, there are three HP1 homologues termed HP1α (Cbx5), HP1β (Cbx1), and HP1γ (Cbx3). Among these three isoforms HP1β is the best characterized. Murine HP1β is essential for organismal survival. Cbx1-/- knockout mice are perinatal lethal and exhibit aberrant cerebral cortex development, reduced proliferation of neuronal precursors, widespread cell death and edema. Cbx1-/- neurospheres cultured in vitro show a dramatic genomic instability. This study demonstrates that Cbx1+/- and Cbx1-/- mouse embryonic fibroblasts (MEFs) escape senescence crisis that is associated with gross chromosomal aberrations including aneuploidy, premature chromosome separations and telomere-telomere fusions. Telomeres of Cbx1-/- MEFs show reduced binding of the shelterin protein TRF1 with no change in the cellular localizations of POT1a, POT1b and TPP1 proteins compared to wild type (WT) cells. Telomere length analysis revealed that the telomeres of late passage Cbx1-/- MEFs are longer (~20 kb) than the WT controls. There was no change in the localization of cohesin protein SMC3, spindle assembly checkpoint protein BUB1 and SGO1. In an in vitro model of oncogene-induced senescence (OIS), introduction of Cbx1-/- mutation in cells expressing H-rasV12 oncogene did not result senescence bypass. In vivo experiments utilizing the inducible K-rasV12 oncogene expression in Cbx1+/- mice resulted in increased malignant adenocarcinomas in lungs, which were negative for the markers of senescence. Taken together these data indicate that HP1β acts as a tumour suppressor rather than mediating senescence in response to oncogenic stress. GST pull down experiments with WT HP1β, HP1β mutants and recombinant histone H3 showed that the binding of HP1β to histone H3 is resistant to 0.75 M NaCl concentrations and that HP1β chromoshadow domain is sufficient for this interaction. Isothermal calorimetry experiments confirmed that the binding affinity of HP1β for recombinant histone H3 was 4 times higher than its affinity for H3K9me3. V23M and F45E (“aromatic cage”) mutations in the HP1β chromo domain were also shown to inhibit binding to H3K9me3 while retaining binding to histone H3. In this study, the role of murine HP1β protein in the regulation of genome stability and senescence has been investigated, which provided insights into the role of HP1β in both processes. It has been shown that there is a high affinity binding of HP1β to the histone H3 histone-fold domain that is stronger than the affinity to H3K9me3. It is proposed that the loss of this high affinity interaction might result in the perinatal lethal phenotype seen in Cbx1-/- mice.

Heterochromatin-Protein-1- (HP1-) Proteine sind grundlegende strukturelle Komponenten des Heterochromatins, die bevorzugt in den Centromeren und Telomeren fast aller eukaryotischer Chromosomen vorkommen. HP1-Homologe finden sich in zahlreichen Organismen und sind an der Bildung und Aufrechterhaltung von Chromatinstrukturen höherer Ordnung beteiligt. Dazu erkennen und binden sie spezifisch (tri- und di-) methylierte Lysin-9-Reste am Histon H3. In Säugern gibt es drei HP1-Homologe, nämlich HP1α (Cbx5), HP1β (Cbx1) und HP1γ (Cbx3), von denen HP1β das am besten charakterisierte darstellt. Das murine HP1β ist unabdingbar für das Überleben des Organismus. Cbx1-/- -Nullmutanten sind perinatal letal und zeigen eine anomale Entwicklung des cerebralen Cortex, eine verringerte Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen, ausgedehnten Zelltod und Ödeme. In vitro kultivierte Cbx1-/- -Neurosphären weisen eine signifikante genomische Instabilität auf. Diese Arbeit zeigt, dass murine embryonale Fibroblasten (MEF) der Genotypen Cbx1+/- und Cbx1-/- der Seneszenzkrise entkommen, die mit erheblichen Chromosomenanomalien einschließlich Aneuploidie, vorzeitiger Chromosomenseperation und Telomer-Telomer-Fusionen einhergeht. Telomere von Cbx1-/- -MEF zeigen eine verringerte Bindung des Shelterin-Proteins TRF1, aber keine Veränderung der zellulären Lokalisation der Proteine POT1a, POT1b und TPP1 im Vergleich zu Wildtyp- (WT-) Zellen. Eine Analyse der Telomerlängen ergab, dass die Telomere von späten Cbx1-/- -MEF-Passagen ~20 kb länger waren als WT-Kontrollen. Es konnten dabei keine Änderungen der Lokalisationen des Kohesinproteins SMC3, des Spindelkontrollpunkt-Proteins BUB1 sowie des SGO1-Proteins festgestellt werden. In einem In-vitro-Modell der Onkogen-induzierten Seneszenz (OIS) resultierte die Einführung der Cbx1-/- -Mutation in H-rasV12-Onkogen exprimierende Zellen nicht in einer Umgehung der Seneszenz. In-vivo-Experimente mit Hilfe einer induzierbaren K-rasV12-Onkogenexpression in Cbx1+/- -Mäusen führten zum vermehrten Auftreten maligner Adenokarzinome der Lunge, wobei diese keine Seneszenzmarker aufweisen. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass HP1β keine Induktion der Seneszenz als Antwort auf onkogenen Stress bewirkt, sondern vielmehr als Tumorsuppressor fungiert. GST-pull-down-Experimente mit WT-HP1β oder HP1β-Mutanten und rekombinantem Histon H3 zeigten, dass die Bindung von HP1β an Histon H3 resistent gegenüber einer Konzentration von 0.75 M NaCl ist und dass die Chromoshadow-Domäne ausreichend für diese Interaktion ist. Isothermale Kalorimetrie-Experimente zeigten, dass die Bindungsaffinität von HP1β zu rekombinantem Histon H3 viermal höher liegt als die Affinität zu H3K9me3. V23M- und F45E- (“aromatischer Käfig-”) Mutationen in der HP1β-Chromo-Domäne zeigten weiterhin eine Inhibition der H3K9me3-Bindung während die Bindung zu Histon H3 erhalten bleibt. In dieser Arbeit wurde die Rolle des murinen HP1β-Proteins bei der Regulation der Genomstabilität und Seneszenz untersucht, wobei sich Einblicke in die Involvierung von HP1β in beide Prozesse ergaben. Es wurde gezeigt, dass HP1β eine hohe Affinität zur histone-fold-Domäne des Histons H3 besitzt, welche über der Affinität zu H3K9me3 liegt. Hieraus ergibt sich, dass der Verlust dieser hochaffinen Interaktion den perinatal letalen Phänotyp von Cbx1-/- Mäusen bedingen könnte.

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Billur, Mustafa: The role of HP1β on genomic stability and cellular senescence.

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