Funktionsanalyse der Zink-Metalloprotease ADAM10 in der Epidermis und im haematopoetischen System der Maus

Weber, Silvio

Eine moegliche Bedeutung der Disintegrin und Metalloproteinase ADAM10 wurde bereits im Vorfeld dieser Arbeit für die Regulation zahlreicher essentieller Signalwege der Morphogenese und Homoeostase der Haut diskutiert. Zur Untersuchung der physiologischen Relevanz von ADAM10 in der Epidermis in vivo erfolgte die selektive Deaktivierung von ADAM10 waehrend der embryonalen Morphogenese und nachfolgend auch in der adulten Haut. Dabei fuehrt die epidermale Deletion von ADAM10 unter Kontrolle des K14-Promotors zu einer perinatalen Letalitaet der Maeuse. Die Maeuse wiesen dabei eine Barrierestoerung und ein Fehlen der Talgdruesen auf. Eine Reduktion des stratum spinosums ohne Unterschiede im Bezug auf Proliferation und Apoptose der Keratinozyten zeigte, dass der Verlust von ADAM10 zu einer fruehzeitigen Maturierung der spinalen Keratinozyten fuehrte. Die wenigen ueberlebenden K14-ADAM10-deletierten Maeuse mit einer postnatalen Defizienz von ADAM10, zeigten einen bleibenden Haarverlust, missgeformte Vibrissae, epidermale Hyperproliferation und Zystenbildung, eine Atrophie des Thymus und einen starke Zunahme der Expression des Keratinozyten-entstammenden Zytokins thymic stromal lymphopoetin (TSLP), welches auf eine nicht zell-autonome Multi-Organ Krankheit durch eine gestoerte Hautbarriere hinweist. Zusammenfassend laesst sich sagen, dass der beobachtete Phaenotyp eine starke Aehnlichkeit mit den Phaenotypen vergleichbarer Notch-defizienter Mausmodelle aufweist und somit auf eine Beeintraechtigung des Notch-Signalweges hinweist. Dabei konnten tatsaechlich eine starke Reduktion der signalaktiven intrazellulaeren Notch Spaltfragmente und der hiermit verbundenen Notch Signalgebung gefunden werden. Die vorliegende Daten bestaetigen die Bedeutung von ADAM10 als hauptsaechliche Sheddase für den S2-Schnitt aller Notch-Rezeptoren in vivo und damit die Funktion von ADAM10 als einen zentralen Regulator der Hautentwicklung und –homoeostase. Nachfolgend wurde ein induzierbar konditionales ADAM10 Knockout Mausmodell unter der Kontrolle des K5-Promotors etabliert, welches die Analyse von ADAM10 in der adulten Haut ohne vorherige Entwicklungsdefekte ermoeglicht. Andauernde ADAM10 Defizienz fuehrt auch in diesen Tieren zu bleibender Alopezie, epidermaler Zystenbildung, einer Reduktion des subkutanen adipoesen Fettgewebes, Hyperproliferation der basalen Keratinozyten und Hyperkeratose. Dies ist das erste beschriebene Modell einer induzierbaren konditionellen ADAM10 Knockout Maus und eroeffnet damit die Moeglichkeit der Anwendung von Experimenten zur in vivo Pharmakologie durch Inhibition der ADAM10 Aktivität zur Behandlung von verschiedenen ADAM10-assoziierten Hautkrankheiten. Im Weiteren konnte ein induzierbar konditionales ADAM10 Knockout Mausmodell unter der Kontrolle des Mx1-Promotors etabliert werden, welches die Deletion von ADAM10 vorrangig in Interferon-sensitiven Zellen des haematopoetischen Systems ermoeglichte. Proteinexpressionsanalysen bestaetigten eine Reduktion der ADAM10 Expression in Geweben der Milz, der Leber und des Knochenmarks und ermoeglichen nachfolgende Experimente zur Analyse der Bedeutung von ADAM10 bei der Homoeostase der genannten Organe. Zusaetzlich konnte gezeigt werden, dass eine fortwaehrende Deletion von ADAM10 in diesem System zur Ausbildung einer chronisch myeloproliferativen Krankheit fuehrt, welche dem klinischen Phaenotyp von humanen Patienten mit einer Osteomyelofibrose aehnelt. Dieser Phaenotyp kann durch eine Granulozytose des Knochenmarks, bei gleichzeitiger Reduktion von unreifen Erythrozyten und Lymphozyten; einer extramedullaeren Haematopoese der Milz, die zu einer ausgepraegten Splenomegalie führt, sowie einer Lymphopenie, Granulozytose und Thrombozytose des peripheren Blutes charakterisiert werden. Dementsprechend wurden erhoehte Plasmakonzentration von G-CSF (einem bekannten klinischen Marker für myeloproliferative Krankheiten) detektiert. Außerdem konnten durch eine Array-basierte Expressionsanalyse von Zytokinen mit nachfolgenden ELISA-Verifizierung ein Erhöhung der TIMP-1 und Interleukin-16 Konzentration gemessen werden, welche moeglicherweise eine Rolle dieser Proteine als klinische Marker für die Entstehung von chronisch myeloproliferativen Krankheiten anzeigt. Hiermit konnte zum ersten Mal in vivo eine essentielle Funktion für ADAM10 bei Zellschicksalsentscheidungen im Zuge der Homoeostase des haematopoetischen Systems gezeigt werden. Daher koennte dieses Mausmodell als ein vielversprechendes klinisches Mausmodell zur Analyse und Behandlung von chronisch myeloproliferativen Krankheiten dienen.

The disintegrin and metalloproteinase ADAM10 has been implicated in the regulation of several key signaling pathways that determine skin morphogenesis and homeostasis. To address the in vivo relevance of ADAM10 in the epidermis ADAM10 was selectively disrupted during skin morphogenesis and in adult skin. K14-Cre driven epidermal ADAM10 deletion leads to perinatal lethality of the mice. These mice are characterized by barrier impairment, and absence of sebaceous glands. A reduction of spinous layers in the ADAM10-deleted skin, which is not associated with differences in either proliferation or apoptosis, indicates that loss of ADAM10 triggers a premature differentiation of spinous keratinocytes. The few surviving K14-ADAM10-deleted mice and mice in which ADAM10 was deleted postnatally showed loss of hair, misformed vibrissae, epidermal hyperproliferation and cyst formation, thymic atrophy and upregulation of the cytokine thymic stromal lymphopoetin (TSLP), thus indicating non cell-autonomous multi-organ disease due to a compromised barrier. Together, these phenotypes closely resemble Notch pathway loss-of-function phenotypes in skin, demonstrating that ADAM10 interferes with Notch signaling. Notch processing was indeed strongly reduced resulting in decreased levels of signaling-competent Notch intracellular domain fragment and functional Notch signaling. The data identify ADAM10 as the major Site-2 processing enzyme for Notch in the epidermis in vivo, and thus as a central regulator of skin development and maintenance. Additionally an inducible conditional ADAM10 Knockout mouse model under the control of the Keratin5-Promoter was established permitting the analysis of ADAM10 in adult skin without developmental defects. Prolonged ADAM10 deficiency in adult skin led to ultimate alopecie, epidermal cyst formation, reduction of subcutaneous adipose fat tissue, hyperproliferation of basal keratinocytes and hyperkeratinisation. This is the first described model of an inducible conditional ADAM10 Knockout mouse model and will give the opportunity to apply in vivo pharmacology research. Thereby possible side-effects due to therapeutical inhibition of ADAM10 activity could be determined. Furthermore it was possible to establish an inducible conditional ADAM10 Knockout mouse model under the control of the Mx1-Promotor allowing disruption of ADAM10 activity preferentially in interferon-sensitive cells of the hematopoietic system. Protein expression analysis could confirm a reduction of ADAM10 expression in tissues of the spleen, the liver and the bone marrow disposing subsequent experiments for the impact of ADAM10 concerning the homeostasis of these organs. Additionally it was shown that prolonged deletion of ADAM10 led to a chronic myeloproliferative disorder resembling the phenotype of human patients suffering from Osteomyelofibrosis (OMF). This phenotype was characterized by myeloid expansion, loss of erythrocytes and lymphocytes from the bone marrow; granulocytic infiltration of multiple organs; extramedullary hematopoiesis of the spleen leading to a pronounced splenomegaly as well as lymphopenia, granulocytosis and thrombocytosis in the peripheral blood. Consequently plasma levels of G-CSF (a well-known clinical marker of myeloproli-ferative disorders) were increased. Moreover an array-based protein expression analysis of cytokines with subsequent ELISA-validation could confirm upregulation of TIMP-1 and Interleukin-16, indicating both as potentially new clinical markers for the manifestation of chronic myeloproliferative disorders in mice and possibly also man. Thus ADAM10 could be confirmed to play an essential role for cell-fate decisions among the homoeostasis of the hematopoietic system in vivo for the first time. Therefore the presented ADAM10-deficient mice may serve as an interesting mouse model for the analysis and treatment of chronic myeloproliferative disorders.

Cite

Citation style:

Weber, Silvio: Funktionsanalyse der Zink-Metalloprotease ADAM10 in der Epidermis und im haematopoetischen System der Maus. 2010.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export