In vitro - Untersuchung zur Wirksamkeit des Matrixmetalloproteinaseinhibitors Triazin TF 17-2 am Beispiel cholangiozellulärer Karzinomzellen

Gutsche, Anne

In dieser Arbeit wurde ein neuer MMP-Inhibitor auf der Basis des Heterozyklus 1,2,4-Triazin TF 17-2 in seiner Wirkung auf Cholangiokarzinomzellen, Gallenblasenfibroblasten aus der Primärkultur, sowie auf schnell wachsende Vorhautfibroblasten (KiF5) getestet. Das Cholangiokarzinom ist eine maligne Tumorerkrankung, deren Prognose insgesamt sehr schlecht ist. Im Anfangsstadium verläuft sie häufig asymptomatisch, so dass die meisten Patienten bei Diagnosestellung ein bereits fortgeschrittenes Tumorleiden aufweisen. Es existiert derzeit keine standardisierte Chemotherapie. Deshalb ist es gerade für Tumoren mit solch schlechten Aussichten wichtig, neue Therapiemaßnahmen zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Gewinnung von primären Gallenblasenfibroblasten aus Teilen nicht tumorös veränderter Gallenblasen. Mittels immunhistochemischer Untersuchungen wurden sie charakterisiert und anschließend kultiviert. Der Effekt des neuen MMP-Inhibitors TF17-2 auf die Zellvitalität wurde mit Hilfe eines kolorimetrischen Proliferationstestes, eines Verfahrens zur Bestimmung der DNA-Neusynthese durch 3H-Thymidin-Einbau, sowie eines Assays zur Ermittlung der DNA-Fragmentierung als Zeichen der Apoptose (Jam-Assay) dargestellt. Diese Versuche führten zu dem Ergebnis, dass TF17-2 in Konzentrationen von 30µM, 60µM und 300µM zu keinen signifikanten Einschränkungen der Zellvitalität führten. Ab einer Konzentration von 3mM MMP-Inhibitorlösung ließ sich eine 20-60%ige Zellvitalitätseinschränkung nachweisen. Hierbei handelte es sich nicht um apoptotische Vorgänge, wie anhand der fehlenden DNA-Fragmentierung im Jam-Assay gezeigt werden konnte, sondern um die Hemmung der Zellproliferation mit Reduktion des mitochondrialen Stoffwechsels. Wie in den Ez4U-Tests und den ³H-Thymidin-Assays (v.a. für die KiF5-Zellen) zu sehen, erwiesen sich die Zellen in einer direkten Kokultur von Tumorzellen und Fibroblasten gegenüber den Einflüssen des MMP-Inhibitors resistenter, als die Einzelkultur der jeweiligen Zelllinien. Der Einfluss von TF17-2 auf die Proteinexpression der MMP`s wurde mittels Westernblotanalyse dargestellt. Zur Beurteilung der aktivierten sezernierten MMP´s wurden Zymographien durchgeführt. Es fiel auf, dass sich in der Zymographie auch in gewissem Maße Banden auf Höhe der Proformen darstellen ließen. So gewinnt man einen Eindruck vom Verhältnis der sezernierten aktivierten, als auch der Proformen der MMP`s. Insgesamt zeigten sich auch hier keine oder nur sehr geringe Auswirkungen, so dass davon ausgegangen werden konnte, dass der Inhibitor keinen Einfluss auf die Expression der sezernierten MMP`s hatte. Die Wirksamkeit des MMP-Inhibitors TF17-2 ließ sich in einem modifizierten Invasionsassay demonstrieren. Grundlage für dieses Experiment bildete ein permeabilisierter Fibroblastenrasen, auf den die zu untersuchenden Zellen direkt ausgesät wurden. Die proteolytische Aktivität der Zellen stellte sich anhand der durch den Fibroblastenverdau entstandenen Invasionshöfe dar. Es konnte hierbei eine sehr effektive MMP-Inhibition gezeigt werden. Die Tumorzellinvasion konnte schon durch eine sehr niedrige Dosierung des Inhibitors blockiert werden und war vollständig reversibel. Somit ließ sich eine in vitro Aktivität des MMP- Inhibitors TF17-2 erfolgreich nachweisen. Zur weiteren Evaluation der Wirksamkeit des MMP-Inhibitors TF17-2 stehen Untersuchungen am Tiermodell noch aus. Zudem wäre es sinnvoll TF17-2 in Kombination mit gängigen Chemotherapeutika zunächst in vitro und später am Tiermodell (in vivo) zu untersuchen.

Cite

Citation style:

Gutsche, Anne: In vitro - Untersuchung zur Wirksamkeit des Matrixmetalloproteinaseinhibitors Triazin TF 17-2 am Beispiel cholangiozellulärer Karzinomzellen. 2010.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export