The functional relevance of MKK4 and MKK7 splice variants in neural cells

Häusgen, Wiebke

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways are ubiquitious and highly expressed in all eukaryotic cells. Diverse stimuli activate MAPKs, whose intracellular network translates and integrates those signals into complex cytoplasmatic and nuclear processes which lead to organized cellular responses, like proliferation, differentiation or apoptosis. The c-Jun N- terminale kinases (JNKs), one subfamily of MAPKs, are considered as essential signalling molecules for the differentiation, regeneration and programmed cell death of neurons. Apart from those physiological functions, JNKs mediate neurodegeneration and are involved in a number of pathologies such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease. In answering the question, how JNKs regulate this functional dichotomy, their upstream activators, mitogen-activated protein kinase kinase (MKK) 4 and MKK7 are largely underestimated. The aim of this thesis was to use stable overexpression of MKK4 and MKK7 to investigate their effects on JNK functions in the rat adrenal pheochromocytoma cell line PC12. During cloning of both known JNK activators in the rat, MKK4 and MKK7β1, two so far unknown splice variants, MKK4∆ and MKK7γ1, were identified. Overexpression of MKK7γ1 in PC12 cells mediated distinct changes in activation and protein levels of JNK isoforms. Consequently, JNK signalling was changed at mRNA, protein and phosphorylation levels of JNK targets, such as transcription factors (c-Jun, p53, c-Myc), cell cycle regulators (p21WAF-1/CIP-1, CyclinD1) and apoptotic proteins (Fas, Bim, Bcl-2, Bcl-xl). Additionally, the assembly of JNK signalosomes was affected. These alterations promoted the sensitivity of PC12 cells towards cell death and repressed proliferation under normal cell growth conditions. After stimulation with taxol and tunicamycin, MKK7γ1 but not MKK7β1 transfection, reduced cell death and even increased cell proliferation. Furthermore, MKK7γ1 partially blocked nerve growth factor (NGF)-induced differentiation of PC12 cells via additional down-regulation of the NGF receptors TrkA and p75 as well as of the differentiation-promoting extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) pathways. These MKK7γ1-triggered effects induced an escape from cell cycle arrest and rendered PC12 cells sensitive to taxol- mediated cell death. Overexpression of MKK4 and MKK4∆ caused opposite effects in PC12 cells. MKK4 decreased the viability of cells under basal conditions and enhanced cell survival following taxol stimulation. In contrast, MKK4∆ increased the number of viable cells under basal conditions, but reduced the viability of taxol-treated cells. Thus, single MKK4 and MKK7 splice variants are powerful inductors of distinct and contrasting JNK actions depending on the cellular context and are at least partially responsible for the dichotomy of JNK signalling.

Die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) sind zentrale Elemente der Signaltransduktion bei allen Eukaryoten. MAPK werden von einer Vielzahl verschiedenster Stimuli aktiviert. In der Zelle bilden sie ein Enzymnetzwerk, dass die Signale aufnimmt und in zytoplasmatische und nukleäre Vorgänge übersetzt, die schließlich zu organisierten zellulären Reaktionen, wie Proliferation, Differenzierung oder Apoptose führen. Eine wichtige Unterfamilie der MAPK sind die c-Jun N-terminalen Kinasen (JNK), die eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung, Regeneration und beim programmierten Zelltod von Neuronen spielen. Abgesehen von diesen physiologischen Funktionen, vermitteln JNK auch Neurodegeneration und sind an einer Vielzahl von Krankheitsbildern wie Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson beteiligt. Bei der Beantwortung der Frage, wie JNK diese funktionelle Dichotomie bewirken, hat man der Bedeutung ihrer Aktivatoren, der Mitogen- aktivierten Proteinkinasekinase (MKK) 4 und MKK7, bisher zu wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Effekt von MKK4 und MKK7 auf JNK- vermittelte Funktionen zu untersuchen. Dazu wurden sie in Phäochromozytom (PC12)-Zellen aus der Ratte stabil überexprimiert. Bei der Klonierung der beiden JNK-Aktivatoren, MKK4 und MKK7β1, wurden zwei bisher unbekannte Spleißvarianten, MKK4∆ und MKK7γ1, in PC12 Zellen identifiziert. Überexpression von MKK7γ1 in PC12-Zellen veränderte die Phosphorylierung und die Proteinmenge von JNK-Isoformen. Infolgedessen war die Wirkung der JNK auf ihre Substrate verändert. Effekte konnten auf mRNA-, Protein- und Aktivitätsebene von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, p53, c-Myc), Zellzyklusregulatoren (p21WAF1/CIP1, CyclinD1) und Regulatoren der Apoptose (Fas, Bim, Bcl-2 und Bcl-xl) beobachtet werden. Zusätzlich war die Zusammensetzung von JNK-Signalosomen verändert. All diese Veränderungen erhöhten die basale Apoptoserate der Zellen und verringerten ihre Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen. Nach Stimulation der Zellen mit Taxol oder Tunicamycin, verringerte MKK7γ1, aber nicht MKK7β1, den Zelltod und verstärkte gleichzeitig die Proliferation. Des Weiteren wurde die durch den Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) eingeleitete Differenzierung von PC12-Zellen durch MKK7γ1 blockiert. Überexpression von MKK7γ1 verringerte die Proteinmengen und Phosphorylierung der NGF- Rezeptoren (TrkA und p75) und einzelner Komponenten differenzierungsfördernder Signaltransduktionswege, wie den Extrazellulären Signal-regulierten Kinase 1/2 (ERK1/2)und Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K). Außerdem verhinderte MKK7γ1 den Zelllzyklusarrest und machte die Zellen so anfällig gegenüber Taxol. Die Überexpression von MKK4 und MKK4∆ in PC12-Zellen bewirkte gegensätzliche Effekte. MKK4 verringerte die Viabilität der Zellen unter basalen Bedingungen und erhöhte die Überlebensrate der Zellen nach Taxol-Stimulation. Im Gegensatz dazu, erhöhte MKK4∆ die Anzahl lebender Zellen unter basalen Bedingungen, verstärkte jedoch den Taxol- induzierten Zelltod. Somit sind einzelne MKK4 und MKK7 Spleißvarianten entscheidende Regulatoren von unterschiedlichen, teils auch gegensätzlichen JNK-Wirkungen in Abhängigkeit von der zellulären Umgebung.

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Häusgen, Wiebke: The functional relevance of MKK4 and MKK7 splice variants in neural cells.

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