Korrelationsbestimmung zwischen Polymorphismen im MC1-Rezeptor Gen und somatischen B-raf und N-ras Mutationen an Primärtumorgewebe des malignen Melanoms

Nordström (geb. Mehnert), Franziska Ulrike

Maligne Melanome stellen den bedeutsamsten Tumor in der Dermato-Onkologie dar. In den vergangenen Jahren konnten die Pathomechanismen der Melanomentstehung und -progression zunehmend gut dargestellt werden durch die Beschreibung von spezifischen Genmutationen in Primärtumoren maligner Melanome. Als Zielstrukturen - durchaus auch für therapeutische Ansätze - wurden insbesondere Mutationen im B-raf und N-ras Gen beschrieben. Dabei treten B-raf Mutationen insbesondere bei Melanomen auf, die einer intermittierenden UV-Exposition ausgesetzt waren, N-ras Mutationen dagegen bei chronischer Exposition. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen dem Melanocortin-1-Rezeptor (MC1R) und Mutationen in B-raf und N-ras besteht. MC1R stellt ein zentrales Gen in der Regulierung der Hautpigmentierung dar. Einige relevante Polymorphismen führen zur Inaktivierung von MC1R bzw. seinem Signalweg und bedingen so eine verminderte Synthese des Eumelanin-Pigments mit reduziertem Schutz vor schädlichen UV-Strahlen. Somit führt ein MC1R-Funktionsverlust mutmaßlich zu einem erhöhten Hautkrebsrisiko. Anhand von insgesamt 90 Melanom-Primärtumoren aus dem histologischen Archiv der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie am Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, wurden in Zusammenarbeit mit der Dermato-Onkologischen Kooperations-einheit des Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg und der Hautklinik Mannheim eine Genotypisierung des Tumorgewebes im Hinblick auf Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) im Gen des Melanocortin-1-Rezeptors sowie der häufigsten somatischen Mutationen im B-raf und N-ras Gen durchgeführt. Zur Genotypisierung von MC1R wurde die Methode des direkten Sequenzierens angewandt, indem es in drei Fragmenten analysiert wurde. B-raf und N-ras wurden mit der Einzelstrang-konformationspolymorphismus-Analyse (Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis, SSCP) und durch direktes Sequenzieren untersucht. An den insgesamt 90 Tumorproben konnte in 80 Fällen die DNA für MC1R erfolgreich isoliert, amplifiziert und sequenziert werden. 80% zeigten mindestens einen MC1R-Polymorphismus. Ein Vergleich zu möglichen Prognoseunterschieden zu einer Kontroll-gruppe von Nicht-Melanom-Erkrankten wurde zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht durchgeführt. Die Analyse der Onkogene B-raf und N-ras, die als Schlüsselmoleküle des sogenannten RAS-RAF-MEK-ERK-Signaltransduktionswegs beim Melanom bekannt sind und entscheidend zur Proliferation von Tumorzellen und Inhibition der Apoptose beitragen, war in 81 bzw. 83 der 90 Tumorproben erfolgreich. In 21% der Fälle zeigte sich eine Mutation in B-raf (Exon 15, Codon 600, V600E-Mutation). Lediglich in 12% der untersuchten Tumorproben fand sich eine N-ras Mutation (Exon 2, Codon 61). Bei den Korrelationsbestimmungen zwischen MC1R- und B-raf/N-ras Mutationen zeigten sich Hinweise dafür, dass MC1R-Polymorphismen das Vorkommen von somatischen Mutationen im B-raf Gen beeinflussen. Träger von MC1R-SNPs haben eine geringere Wahrscheinlichkeit für somatische B-raf Mutationen. Häufiger treten B-raf Mutationen hingegen bei Melanomprimärtumoren auf, die die sogenannte MC1R-Konsensussequenz tragen. Zwischen MC1R und N-ras konnte kein signifikanter Zusammenhang beschrieben werden. Bei einer anschließenden Assoziationsbestimmung zwischen den klinischen Daten und insbesondere dem Verlauf der Erkrankung der Melanompatienten und den Ergebnissen der Genanalysen zeigte sich eine Korrelation zwischen einem Tumorprogress im Sinne einer Metastasierung und B-raf Mutationen im Primärtumor. Diese Ergebnisse sind gerade im Jahr 2010 von besonderem Interesse, weil jetzt erstmals sogenannte B-raf-Inhibitoren mit bisher schon eindrucksvollen Erfolgen in allerdings noch frühen klinischen Studien eingesetzt werden. Diese wirken offensichtlich nur in Patienten mit einer V600E-Mutation im B-raf Gen, so dass der „Traum“ von zielgerichteten Therapien („targeted therapies“) beim malignen Melanom vielleicht schon bald der Realität angehören könnte.

Malignant melanoma is the most aggressive skin tumour, arising due to malignant transformation of melanocytes. Within the last years increasing knowledge about mutations occurring in primary melanoma tumours sharpened the picture of the etiology of melanoma formation. Particularly, mutations in the B-raf and N-ras genes are frequently found in melanoma tumours, and are considered as targets for treatment of the disease. B-raf and N-ras function in the RAS-RAF-MEK-ERK signal cascade, regulating proliferation, survival and apoptosis. While B-raf mutations mainly occur in melanomas of intermittent sun exposure, N-ras mutations can be found on chronically sun exposed tumours. The Melanocortin-1-receptor (MC1R) is crucial in the regulation of skin pigmentation and believed to be a major contributor to human pigmentation variation. Various polymorphisms in the gene show impaired receptor function, leading to reduced synthesis of the dark sun protective eumelanin. Thus, loss of function of MC1R potentially leads to an increased risk of melanoma. The aim of the present thesis was the investigation of a possible association between variants in the Melanocortin-1-receptor (MC1R) gene and mutations in the B-raf and N-ras genes. For this project 90 primary melanoma tumours from the Department of Dermatology, University Hospital Schleswig-Holstein, Campus Kiel, in collaboration with the German Cancer Research Center, Heidelberg, and the Clinic of Dermatology, Mannheim, were screened for single nucleotide polymorphisms in the MC1R gene and for somatic mutations in the B-raf and N-ras genes. MC1R was genotyped in three fragments using direct sequencing, while mutations in B-raf and N-ras were detected through the Single Strand Confirmation Polymorphism method (SSCP) followed by direct sequencing. MC1R could successfully be genotyped in 80 tumours. In 80% of the investigated tumours at least one MC1R variant was observed. The analysis of mutations in the B-raf and N-ras genes was successfully performed in 81 and 83 tumours, respectively. B-raf mutations (exon 15, codon 600, V600E mutation) were observed in 21% of the investigated tumours, while N-ras mutations (exon 2, codon 61) were present in only 12% of the tumours. The investigation of the association between the presence of MC1R variants and the occurrence of somatic B-raf/N-ras mutations showed a tendency to a negative correlation between MC1R variants and B-raf mutations. In carriers of at least one MC1R polymorphism B-raf mutations were observed less frequently compared to non carriers. A similar trend could not be observed between MC1R variants and N-ras mutations. We also investigated the association between clinical data of the patients, with the main interest in progression of the disease, and the data obtained from the genotyping of MC1R, B-raf and N-ras. A significant association between tumour progression in terms of metastasis and the presence of mutations in B-raf was observed. Our results are of great interest, especially now, that kinase inhibitors targeting the B-raf V600E mutation showed impressive success in an early clinical trial. In this respect, targeted therapies of melanoma patients might become reality in the near future.

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Nordström (geb. Mehnert), Franziska: Korrelationsbestimmung zwischen Polymorphismen im MC1-Rezeptor Gen und somatischen B-raf und N-ras Mutationen an Primärtumorgewebe des malignen Melanoms. 2010.

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