Unterschiedliche Funktionen von Trail-Rezeptor 1 und Trail-Rezeptor 2 in Pankreaskarzinom-Zellen

Lemke, Johannes

Das Pankreaskarzinom hat trotz chirurgischer und chemotherapeutischer Therapie eine infauste Prognose. Seit einiger Zeit wird TRAIL als neue Therapieoption für Malignome erprobt. TRAIL ist ein Todesligand, der in Tumorzellen Apoptose auslösen kann, andere Zellen jedoch unbeschadet lässt. Neben TRAIL werden auch monoklonale agonistische Antikörper gegen TRAIL-Rezeptoren in klinischen Studien eingesetzt. Da TRAIL an zwei unterschiedliche Todesrezeptoren (TRAIL-R1 und TRAIL-R2) binden kann, wurden in der vorliegenden Arbeit die spezfischen Funktionen der beiden Rezeptoren in Pankreaskarzinom-Zellen untersucht. Die TRAIL-Rezeptor-Expression von Pankreaskarzinom-Zelllinien wurde mittels Western-Blot und Durchflusszytometrie analysiert. Pankreaskarzinom-Zellen wurden mit TRAIL oder mit, bereits in klinischen Studien evaluierten, agonistischen Antikörpern HGS-ETR1 (aktiviert TRAIL-R1) und HGS-ETR2 (aktiviert TRAIL-R2) stimuliert. Zur Hemmung des jeweiligen Rezeptors wurden antagonistische anti- TRAIL-R1/-TRAIL-R2-Antikörper verwendet. Zur Inhibition von PKC wurde GÖ6983 und zur Inhibition von MEK UO126 eingesetzt. Vitalität der Zellen wurde mittels Kristallviolett-Assay, NF-kB-Induktion mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und Sezernierung von IL8 mittels ELISA bestimmt. Rezeptor-Lokalisation wurde mittels Immunfluoreszenz, die Rezeptorkomplexe wurden mittels Immunopräzipitation analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle untersuchten Pankreaskarzinom-Zelllinien TRAILR1 und TRAIL-R2 auf der Zelloberfläche exprimierten. Weiter induzierte TRAIL in diesen Zellen Apoptose und eine pro-inflammatorische Antwort (NF-kB und IL-8). Interessanterweise zeigte der Einsatz von antagonistischen Antikörpern gegen TRAIL-R1 bzw. -R2 in Kombination mit TRAIL-Stimulation, dass die TRAIL-induzierte Apoptose und nicht-apoptotische Antwort fast ausschließlich über TRAIL-R1 vermittelt wird. Dass jedoch beide Rezeptoren potentiell funktionsfähig sind, zeigte die Stimulation mit agonistischen Antikörpern. Sowohl HGS-ETR1 als auch HGSETR2 induzierten Apoptose, NF-kB und IL-8. Die Analyse der Rezeptorkomplexe zeigte, dass TRAIL-Stimulation zur Entstehung von Heterokomplexen aus TRAIL-R1 und TRAIL-R2, die Stimulation mit agonistischen Antikörpern hingegen zur Entstehung von Homokomplexen aus entweder TRAIL-R1 oder TRAIL-R2 führt. Weiter konnte nach TRAIL-Stimulation eine weitere, kleinere TRAIL-R2-Form identifiziert werden, die in der Molekulargröße einer nicht-glykosilierten Form entspricht. Die Untersuchung von Signaltransduktionswegen zeigte, dass die Hemmung von MEK Pankreaskarzinom-Zellen für TRAIL-vermittelte Apoptose ausschließlich über TRAIL-R1 sensibilisiert. Hingegen sensibilisiert die Hemmung von PKC die TRAIL-vermittelte Apoptose über beide Rezeptoren. Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass TRAIL-R1 und -R2 auf der Zellmembran und im Zytoplasma lokalsiert sind. Interessanterweise konnte TRAILR2 zusätzlich auch im Zellkern nachgewiesen werden. Parallel durchgeführte Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung und Identifizierung der Rezeptor-assoziierten Proteine zeigte, dass TRAIL-R2 (nicht aber TRAIL-R1) mit zahlreichen Kernproteinen assoziiert ist, die am Splicing und der Regulation der Genexpression beteiligt sind. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pankreaskarzinom- Zellen funktionsfähigen TRAIL-R1 und TRAIL-R2 exprimieren, die nach selektiver Stimulation beide Apoptose auslösen können. Die apoptotische und proinflammatorische Antwort nach Stimulation mit dem natürlichen Liganden TRAIL wird jedoch nahezu ausschließlich über TRAIL-R1 vermittelt. Interessanterweise kann der TRAIL-R2 durch die Hemmung der anti-apoptotischen PKC reaktiviert werden. Eine mögliche Erklärung für die Inaktivität des TRAIL-R2 ist die Bildung von Heterokomplexen nach TRAIL-Stimulation oder der Einfluss der nicht-glykosilierten TRAIL-R2-Form. Zusätzlich lieferten die Ergebnisse dringende Hinweise auf die Beteiligung von TRAIL-R2 an Splicing- und Genregulationsvorgängen.

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Lemke, Johannes: Unterschiedliche Funktionen von Trail-Rezeptor 1 und Trail-Rezeptor 2 in Pankreaskarzinom-Zellen. 2010.

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