HM1.24 gerichtete bispezifische single-chain-Fv Antikörper zur Therapie des Multiplen Myeloms

Ehlert, Claudia

Das Multiple Myelom ist eine maligne Erkrankung, dessen Prognose durch die aktuellen therapeutischen Möglichkeiten deutlich gebessert, aber in der Regel weiterhin nicht heilbar ist. Die Entwicklung zusätzlicher immuntherapeutischer Strategien könnten ein möglicher Weg sein, um eine minimale Resterkrankung zu eliminieren und damit Langzeitremissionen zu erreichen. Ein vielversprechender Weg ist der Einsatz von Antikörpern. Bei der Therapie des Multiplen Myeloms spielten Antikörper bisher keine größere Rolle, da für Myelomzellen nur wenig geeignete Zielmoleküle definiert sind. HM1.24 wurde als ein Oberflächenmolekül identifiziert, welches auf terminal differenzierten B-Zellen hochexpremiert wird und auf Myelomzellen überexprimiert wird. Fc-Rezeptor-vermittelte Mechanismen wie ADCC spielen eine wichtige Rolle für die Antitumoraktivität von therapeutischen Antikörpern. Durch gezieltes Ansteuern aktivierender Fc-Rezeptoren lässt sich die therapeutische Effizienz von Antikörpern steigern. Eine Möglichkeit zur Verbesserung der Effektorzellrekrutierung bieten bispezifische Antikörper, die mit hoher Affinität an den jeweiligen aktivierenden Fc-Rezeptor binden. Die Effektorzell-vermittelte Lyse über HM1.24 kann möglicherweise durch Verwendung eines bispezifischen Antikörpers erhöht werden. In dieser Arbeit wurde ein rekombinanter bispezifischer single-chain Fv HM1.24xCD16 Antikörper (Tandem-Format) entwickelt, der die gezielte Rekrutierung von CD16-positiven Zellen ermöglicht. Ein bispezischer single-chain Fv HM1.24 x CD16 ist durch seine beiden Antigenbindungstellen in der Lage, HM1.24-positive Myelomzellen und CD16-positive Effektorzellen in räumliche Nähe zu bringen, und über die Aktivierung von diesen Effektorzellen, wie NK-Zellen und Makrophagen, eine zytotoxische Immunantwort mittels ADCC zu induzieren. Zur Herstellung des bsscFv HM1.24xCD16 wurde das scFv Fragment von einem monoklonalen HM1.24 mit dem scFv Fragment gegen CD16 kloniert und rekombinant in 293T exprimiert. Anschließend erfolgte eine zweistufige Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie über den Hexahistidin-Tag und Strep-Tag. Durch Western-Blots und Coomassie wurde kontrolliert, ob die Expression sowie die Aufreinigung erfolgreich waren. Dabei wurde eine Bande bei ca 60-65kDa detektiert, was dem erwarteten Molekulargewicht des bsscFv entspricht. Die spezifische Bindung der aufgereinigten Proteine an ihre Zielantigene, HM1.24 und CD16, wurde mittels Immunfluoreszenzanalysen an Antigen-positiven Zellen als auch an Antigen-negativen Zellen untersucht. Als nächstes wurde der bispezifischen HM1.24xCD16 auf seine Fähigkeit untersucht, die spezifische Lyse HM1.24-positiver Zellen zu induzieren durch Rekrutierung von Effektorzellen. Der Antikörper wurde für Zytotoxizitätsuntersuchungen in Form eines 51Cr-Release-Assay eingesetzt. Die Tests wurden mit frisch isolierten, unstimulierten mononukleären Zellen (MNC) aus verschiedenen gesunden Spendern und verschiedenen B-Zell-Linien/Myelomlinien sowie an primären humanen Tumorzellen durchgeführt. In vitro weist der bsscFv HM1.24xCD16 an verschiedenen Zelllinien (ARH-77, RPMI 8226, INA-6, U266, primäre humane Tumorzellen) eine höhere Lyserate auf im Vergleich zum monoklonalen HM1.24. Auch in Untersuchungen, die in Abhängigkeit der eingesetzten Antikörperkonzentrationen sowie in Abhängigkeit des Effektor-zu-Target Verhältnisses durchgeführt wurden, zeigte sich der bsscFc dem monoklonalen Antikörper überlegen. Entsprechende Kontroll-Experimente mit blockierenden Antikörpern zeigen, dass die Lyse spezifisch über den bsscFv HM1.24xCD16 induziert wird. Es wurde gezeigt, dass der rekombinante bsscFv HM1.24xCD16 NK-Zellen an Myelomzellen rekrutiert und durch zelluläre Zytotoxizität Tumorzelllyse induziert.

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Ehlert, Claudia: HM1.24 gerichtete bispezifische single-chain-Fv Antikörper zur Therapie des Multiplen Myeloms. 2010.

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