Untersuchungen zum Proteom des Transkriptionsaktiven Chromosoms aus Spinatchloroplasten

Melonek, Joanna

Plastiden besitzen eigene DNA (ptDNA), die zusammen mit einer Vielzahl an Proteinen in Strukturen verpackt ist, die den bakteriellen Chromosomen ähneln. Diese Nukleoproteinkomplexe werden als plastidäre Nukleoide oder Plastidenkerne bezeichnet. Im Unterschied zum Chromatin im Zellkern gibt es nur wenige Informationen über die Organisation und Dynamik der Nukleoide in den Plastiden. Zur Identifizierung von Proteinen des Transkriptionsaktiven Chromosoms (TAC) aus Spinatchloroplasten wurden Proteomanalysen durchgeführt. In einer voran-gegangenen Proteomanalyse mit einer TAC-Fraktion aus Senfchloroplasten wurde das DNA-Bindeprotein Whirly1 identifiziert. Mit dem spezifischen Antikörper konnte hier gezeigt werden, dass das Protein in der konventionell präparierten TAC I Fraktion, aber nicht in der hochaufgereinigten TAC-II-Fraktion von Gersten-chloroplasten vorkommt. Durch eine Proteomanalyse der hochaufgereinigten TAC II Fraktion konnten darüber hinaus sechs neue DNA-Bindeproteine identifiziert werden. Sie wurden als plastidäre nukleoidassoziierte Proteine (ptNAP) benannt. Eines der neu identifizierten ptNAP ist das Protein AtSWIB-1 (Arabidopsis thaliana SWIB domain-containing protein-1). Das Protein ist in der TAC-II-Fraktion ange-reichert und bindet an plastidäre DNA. Dies deutet darauf hin, dass das SWIB-1-Protein im Unterschied zum Whirly1-Protein eine integrale Komponente des TAC ist. Durch Fusionen mit dem GFP-Protein konnte eine duale Lokalisation des AtSWIB-1-Proteins im Zellkern und in den Nukleoiden der Plastiden gezeigt werden. Daten-bankrecherchen erlaubten die Identifizierung von drei weiteren SWIB-Domänen-proteinen von Arabidopsis thaliana, deren vorhergesagte plastidäre Lokalisation durch GFP-Fusionen bestätigt werden konnte. Zusammen mit SWIB-1 gehören sie zu den ersten Chromatinmodellierungsfaktoren, die außerhalb des Kerns vorkom-men. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Plastiden Chromatinmodellierungsproteine besitzen, die über Veränderungen in der Struktur der Nukleoide die Genexpression beeinflussen können.

Chloroplasts possess their own DNA (ptDNA), which is packaged with proteins into structures analogous to bacterial chromosomes, termed nucleoids or plastid nuclei. In contrast to nuclear chromatin, there is only limited information on the organization and dynamics of the plastid nucleoids. In order to investigate the protein composition of the transcriptionally active chromosome (TAC) fractions from chloroplasts and to identify new components of it, proteomic analyses were performed. One of the DNA-binding proteins identified in a previous study was the Whirly1 protein. Immunological experiments with an antibody specific for HvWhirly1 allowed the detection of the protein in a conventionally prepared TAC-I fraction from barley chloroplasts but not in a highly purified TAC-II fraction. By proteome analyses with the highly purified TAC-II fraction, six new DNA-binding proteins were identified. They were named plastid nucleoid-associated proteins (ptNAP). One of newly identified ptNAPs is the AtSWIB 1 (Arabidopsis thaliana SWIB domain-containing protein-1) protein. Immuno-logical analyses with an antibody specific for AtSWIB-1 allowed the detection of the SWIB-1 protein in both the conventionally prepared TAC-I and the highly enriched TAC-II fraction from spinach chloroplasts indicating that SWIB-1 in contrast to Whirly1 is a core component of TAC. An AtSWIB-1:GFP fusion protein was shown to be dually located in the nucleus and in plastid nucleoids. Binding of the SWIB-1 protein to plastid DNA was confirmed by Southwestern analysis. Database searches revealed that SWIB-1 together with further five SWIB-domain proteins belong to a subgroup of the SWIB family being predicted to be targeted to organelles. Fusions with GFP protein confirmed a plastid location for three of them. Together with SWIB-1, these proteins are the first identified chromatin remodeling factors being imported into plastids. Based on these findings, it is hypothesized that plastids possess chromatin remodeling proteins in order to regulate the expression of their genes by introducing structural changes of the nucleoid.

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Melonek, Joanna: Untersuchungen zum Proteom des Transkriptionsaktiven Chromosoms aus Spinatchloroplasten. 2010.

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