Untersuchungen zur Rolle des Profilaggrin-Proteins FLG3605-3879 in der antimikrobiellen Hautabwehr

Babian, Sarah Katherina

Antimikrobielle Peptide gehören zur chemischen Barriere der menschlichen Haut und tragen dazu bei, dass diese trotz einer hohen Besiedelung durch Mikroorganismen ausgesprochen selten infiziert wird. In der Unterstützung der natürlichen Resistenz der Haut exprimieren die Keratinozyten konstitutive und induzierbare antimikrobielle Peptide, darunter RNase-7, Psoriasin und Lysozym. Für die epidermalen „S100 Fused Type“-Proteine Hornerin und Ifapsoriasin konnte ebenfalls antimikrobielle Aktivität nachgewiesen werden. Ein weiteres Protein dieser Familie ist das über 400 kDa große Profilaggrin. Seine Funktion in der epidermalen Differenzierung ist seit langem bekannt. Als Strukturprotein ist Filaggrin im Zuge der Keratinisation an der Ausbildung des „Cornified Cell Envelope“ beteiligt. Desweiteren dienen seine Abbauprodukte als wichtige Feuchtigkeitsspender der Hydratation der Haut. Bei Patienten mit Atopischer Dermatitis führen Mutationen im Filaggrin-Gen zu einer Störung der Barrierefunktion. Es zeigt sich ein Krankheitsbild mit starker Austrocknung der Haut und einer erhöhten Infektanfälligkeit. Daher könnte vermutet werden, dass Peptidfragmente des Profilaggrins antimikrobielle Eigenschaften aufweisen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein C-terminales Fragment des Profilaggrins zur Bakterienabwehr beitragen und so die Integrität der Haut fördern könnte. Ziel war es, das Profilaggrin-Fragment FLG3605-3879, dessen Sequenz einen Teil des letzten C-terminalen Filaggrin-Repeats sowie des C-terminalen trunkierten Filaggrins einschließt, näher auf mögliche antimikrobiellen Eigenschaften zu untersuchen. Zur Generierung des rekombinanten Proteins wurde das Fragment zunächst mittels Standard- und „Nested“-PCR amplifiziert. Als DNA-Material wurde cDNA aus ausdifferenzierten humanen Keratinozyten neonataler Vorhautepidermis gewählt. Zur Vervielfältigung des PCR-Produktes wurde das Fragment in den Klonierungsvektor pGEM-T ligiert, der in E. coli TOP10 Zellen transformiert wurde. Für die Expression des rekombinanten Profilaggrin-Proteins wurde das Fragment in den Expressionsvektor pSUMO3 kloniert und der geschlossene Vektor in die E. coli BL21 (DE3) pLysS Zellen transformiert. Das rekombinant exprimierte Protein FLG3605 3879 wurde chromatographisch aufgereinigt. In der anschließenden massenspektrometrischen Analyse wurde neben dem FLG3605-3879-Protein ein weiteres Protein detektiert. Bei diesem Produkt handelt es sich um ein kleineres Protein, welches aufgrund seiner Masse und in Übereinstimmung mit Sequenzanalysen sehr wahrscheinlich eine trunkierte Version des FLG3605-3879-Profilaggrin-Proteins darstellt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten diese Proteine nicht voneinander getrennt werden. Für die abschließende antimikrobielle Testung der Proteinprobe wurden der Gram-positive Bakterienstamm Staphylococcus aureus ATCC 6538, die Gram-negativen Stämme Escherichia coli ATCC 11775 und Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 sowie die Hefe Candida albicans ATCC 24433 ausgewählt. Die vorliegenden Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass das C terminale Fragment FLG3605 3879 in den eingesetzten Konzentrationen keine antimikrobielle Aktivität gegen die ausgewählten Testorganismen besitzt. Dennoch tragen diese Erkenntnisse zum weiteren Verständnis der antimikrobiellen Peptide der Haut bei. In der Erforschung zukünftiger therapeutischer Ansätze im Einsatz natürlicher Antibiotika sind weitere Untersuchungen des Profilaggrins hinsichtlich seiner möglichen antimikrobiellen Eigenschaften weiterhin von großem Interesse. Insbesondere bei Dermatosen, die mit Hautbarriere-Defekten einhergehen, ist die Bedeutung von Profilaggrin nach wie vor nicht ausreichend geklärt.

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Babian, Sarah: Untersuchungen zur Rolle des Profilaggrin-Proteins FLG3605-3879 in der antimikrobiellen Hautabwehr. 2011.

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