Peptidoglycan Recognition Protein 3: a novel Microbial Pattern Recognition ReceptorMediating Immune Regulation Depending onMicrobial and Dietary Factors

Zenhom Mahmoud, Marwa

Intestinal microorganisms are recognized by Toll-like receptors (TLRs), nucleotidebinding oligomerization domain-containing proteins (NODs) and peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). PGRPs are a novel family of microbial pattern recognition receptors that recognize bacterial peptidoglycan and function in antibacterial innate immunity. The mammalian PGlyRP family consists of four members: PGlyRP1, 2, 3 and 4. Many studies have focused on the role of TLRs and NODs in immune response, whereas the expression and immunological role of PGlyRPs had gained less attention. Also, many studies have focused on the intestinal immune modulation by dietary fatty acids (FFA), prebiotic products and probiotic bacteria, which are also able to produce shortand branched-chain fatty acids (SCFA and BCFA). The mechanisms of this immunomodulation are still not fully understood. Hypothesising that nutrition and intestinal microbes may be involved in immunomodulation through PGlyRPs, the present study aimed to investigate the role of bacterial and dietary FFA and prebiotic products in the inflammation in intestinal Caco-2 cells, and to elucidate the impact of PGlyRP3 in the immune response and inflammation in these intestinal cells. PCR and Western blot demonstrated the expression of only PGlyRP3 in Caco-2 cells. This expression was enhanced by the PPARγ agonist GW1929 and other PPARγ ligands (bacterial and dietary FFAs). This result was supported by the observed physical binding of PPARγ to the PGlyRP3 promoter, as demonstrated by EMSA. Overexpression / silencing of PGlyRP3 decreased / increased gene expression of proinflammatory cytokines (IL-12, IL-8, TNF-α). FFAs that induced PGlyRP3 inhibited expression of these cytokines. Silencing of the PGlyRP3 gene caused the same FFAs to increase the cytokine gene expression. The oligosaccharides α3-sialyllactose and fructo-oligosaccharides (Raftilose p95) increased the expression of PGlyRP3, reduced the expression of IL-12 p35, IL-8 and TNF-α, and reduced IL-12 release. Both oligosaccharides induced PPARγ expression. PPARγ antagonists abolished the oligosaccharide–induced inhibition of cytokines’ expression.Different peptidoglycans (PGNs) increased significantly the expression of IL-12p35, IL-8 and TNF-α and the secretion of IL-12, although they enhanced PGlyRP3 expression. PGlyRP3 overexpression, together with the inhibition of MyD88, which is a central adaptor protein of the TLR pathway, significantly reduced the expression of proinflammatory cytokines. A negative regulation of the NF-κB pathway, including up-regulation of IκBα and down regulation of NF-κB and COX-2, was involved in the anti-inflammatory effects of PGlyRP3. It is concluded that PGlyRP3 has an anti-inflammatory effect. Oligosaccharides and FFAs mediated their anti-inflammatory effect depending on PPARγ and PGlyRP3. Microbial PGNs act proinflammatory due to TLR pathway activation, prevailing PGlyRP3’s antiinflammatory action. When PGlyRP3 expression is increased, the balance may be shifted towards lower levels of inflammation. The results of this study imply that nutrition (lipophilic ligands of PPAR, prebiotic oligosaccharides) and microbial products (PGNs and FFA) are able to modulate immunity in intestinal Caco-2 cells by modulation of PGlyRP3 expession.

Intestinale Mikroorganismen werden von Toll-Like Rezeptoren (TLRs), Nucleotidebinding Oligomerization Domain-containing Proteinen (NOD) und Peptidoglycan Recognition Proteinen (PGRPs) erkannt. PGRPs gehören zur Familie der Pattern Recognition Rezeptoren, welche bakterielle Peptidoglykane erkennen und eine Rolle bei der Antwort des angeborenen Immunsystems auf Bakterien spielen. Die humane PGlyRP Familie besteht aus vier Mitgliedern: PGlyRP1, 2, 3 und 4. Anders als TLRs und NODs ist über die Expression und immunologische Funktion der PGlyRPs im Darm kaum etwas bekannt. In zahlreiche Studien konnten immunmodulierende Eigenschaften von Nahrungsfettsäuren, prebiotische Produkte und probiotische Bakterien, die kurzkettige (SCFA) and verzweigtkettige Fettsäuren (BCFA) synthetisieren können, gezeigt werden. Die dabei zugrunde liegenden Mechanismen sind aber nur zum Teil aufgeklärt. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der durch PGlyRP3 vermittelten immunmodulierenden Wirkung von Nahrungsfaktoren und intestinalen Mikroorganismen. Die Rolle bakterieller und Nahrungsfettsäuren und prebiotischer Produkten auf Entzündungsprozesse wurde in den intestinalen Caco-2-Zellen untersucht. Weiterhin wurde der Einfluss des PGlyRP3 auf die Immunantwort und Entzündungsprozesse in diesen intestinalen Zellen aufgeklärt. In der intestinalen Zelllinie (Caco-2) konnte mittels PCR und Western-Blot die Expression des PGlyRP3–Gens gezeigt werden. Diese Expression konnte durch PPARγ Agonist GW1929 und Liganden (bakterielle und Nahrungsfettsäuren) induziert werden. Dieses Ergebnis wurde durch die beobachtete physikalischen Bindung zwischen PGlyRP3 Promoter und PPARγ unterstützt, wie EMSA zeigte. Durch Überexpression / Silencing von PGlyRP3 wurde die Expression der proinflammatorischen Zytokine IL-8, IL-12 und TNF-α unterreguliert / erhöht. FFA, welche PGlyRP3 induzierten, inhibierten die getesteten Zytokine. Das Silencing von PGlyRP3 wiederum führte zu einer FFA-vermittelten Aktivierung der Zytokinexpression. Die Oligosaccharide α-3-Sialyllactose und Fructooligosaccharid (Raftilose p95) erhöhten die Expression von PGlyRP3 und inhibierten die Expression von IL-12p35, IL-8 und TNF-α und die Sekretion von IL-12. Beide Oligosaccharide induzierten darüber hinaus dieExpression von PPARγ, während PPARγ Antagonisten die Oligosaccharid-induzierte Inhibierung der Zytokinexpression aufhoben. Obwohl die untersuchten Peptidoglykane (PGNs) die Expression von PGlyRP3 erhöhten, stieg die Genexpression von IL-12 p35, IL-8 und TNF-α sowie die Sekretion von IL-12. Die Überexpression von PGlyRP3 und die Hemmung von MyD88 – ein zentrales Adaptormolekül des TLR-Signalweges – führten zu einer signifikant geringeren Expression proinflammatorischer Zytokine. Eine negative Regulation des NF-κB Signalwegs, gezeigt an der Aktivierung von IκBα sowie der Hemmung von NF-κB und COX-2, ist am anti-inflammatorischen Effekt von PGlyRP3 beteiligt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass PGlyRP3 anti-inflammatische Effekte aufweist. Der Oligosaccharid-vermittelte anti-inflammatorische Effekt ist von PPARγ und PGlyRP3 abhängig. Mikrobielle PGNs wirken über den TLR Signalweg proinflammatorisch und überdecken dadurch die anti-inflammatorische Wirkung von PGlyRP3. Ist die Expression von PGlyRP3 erhöht, verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung einer geringeren Entzündungsaktivität. Die Ergebnisse dieser Studie lassen den Schluss zu, dass Ernährungsfaktoren (lipophilic ligands, Prebiotika, Oligosaccharide) und mikrobielle Produkte (PGNs, Fettsäuren) über PGlyRP3 eine immunmodulierende Wirkung aufweisen.

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Zenhom Mahmoud, Marwa: Peptidoglycan Recognition Protein 3: a novel Microbial Pattern Recognition ReceptorMediating Immune Regulation Depending onMicrobial and Dietary Factors. 2011.

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