Entwicklung inhalierbarer lyophilisierter Proteinformulierungen und geeigneter Inhalationssysteme

Pfeffer, Jan Frederik

In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung pulmonal applizierbarer gefriergetrockneter Formulierungen mit Insulin als Modellprotein und geeigneter Inhalationssysteme zur Dispergierung dieser beschrieben. Um diese Ziele zu erreichen, wurden zunächst Proteinformulierungen auf Basis von verträglichen und mit Ausnahme von Polysorbat 80 körpereige-nen Substanzen entwickelt. Neben Insulin als Wirkstoff wurden L-Glutaminsäure, L-Leucin, myo-Inositol und Polysorbat 80 verwendet. Eine physiko-chemische Charakterisierung der verschiedenen Formulierungsansätze führte zur Auswahl einer besonders geeigneten Formulierung, bestehend aus Insulin, L-Glutaminsäure und Polysorbat 80. Diese Formulierung konnte hinsichtlich der kritischen Formulierungstemperatur von -28°C überzeugen und ließ sich mit den vorhandenen Gefriertrocknern problemlos lyophilisieren. Das Insulin liegt in dieser Formulierung einge-bettet in einer teilkristallinen Hilfsstoffmatrix vor. Die amorphe Phase der Hilfsstoffmatrix stabilisiert es während der Lyophilisation, während die kristalline Phase dem Lyophilisat Struktur verleiht und so dessen Kollaps verhindert. Langzeitbeobachtungen an gelagerten Lyophilisaten beweisen die mechanische Stabilität. Der Hilfsstoffkonzentration kommt dabei eine entscheidende Rolle zu: Hohe Hilfsstoffkonzentrationen führten zu einer vollständigen Stabilisierung des Wirkstoffes, waren aber im Hinblick auf die Generierung eines lungengängigen Aerosols nicht überzeugend. Niedrige Hilfsstoffkonzentrationen führten zu einer akzeptablen Feinpartikelfraktion des Aerosols, induzierten jedoch deutliche Einbußen an biologischer Aktivi-tät während der Lyophilisation und damit zu inakzeptablem Wirkverlust. Insulin ist mit einem Milligramm pro Einzeldosis vergleichsweise hoch dosiert. Viele inhalativ zur Anwendung gebrachte Wirkstoffe sind hochpotent und kommen daher, wie zum Beispiel das Anticholinergikum Tiotropi-umbromid, in Konzentrationen von 18 µg pro Einzeldosis auf den Markt. Bei Verwendung eines ebenfalls niedrig dosierten Proteins nivelliert sich dieser Konflikt zwischen Dispergierbarkeit und Stabilität. Dies ist im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht worden. Messungen der aerodynamischen Partikelgrößenverteilung der dispergierten Lyophilisate zeigten die Eignung dieser Arzneiform zur pulmonalen Therapie. Bedingt durch die sehr geringe Dichte der entwickelten Formulierung von nur 0,006 g/cm³ kann sie durch einen Gasimpuls beliebiger Natur spontan in ein Trocken-pulveraerosol überführt werden. Dieses Prinzip der Dispergierung nutzen beide der entwickelten Inhalationssysteme. Der erste entwickelte Inhalator nutzt einen aktiven Dispergiermechanismus zur Aerosolisierung der ge-friergetrockneten Zubereitung. Dieses System generierte Aerosole mit Feinpartikelfraktionen von etwa 20%, bezogen auf die ausgewiesene Dosis. Diese konnten durch Optimierungsversuche nicht gesteigert werden, so dass von einer weiteren Entwicklung durch beispielsweise Testung weiterer Dispergierdrücke oder Verwendung eines größeren Spacers abgesehen wurde. Es wurde daher die Entwicklung eines weiteren Inhalationssystems angestrebt, das die aus der Entwicklung des vorangegangenen Inhalators gewonnenen Informationen zur Dispergierung nutzt. Dieser zweite entwickelte DPI ist atemzuggesteuert, das heißt, der Patient selbst steuert den Dispergiervorgang. Er weist einige Vorteile gegenüber der ersten Entwicklung auf: Er ist erheblich kleiner, benötigt kein Druckgas und generiert Aerosole von besserer Qualität. Die Dispergierleistung lag schon bei Ver-wendung eines ersten Prototypes bei der des optimierten aktiven Inhalators. Auf Basis von statistischen Versuchsplänen und Vergrößerung der Geometrien konnte diese Leistung schrittweise optimiert werden. Die finale Version des Inhalators zeigt eine akzeptable Feinpartikelfraktion bezogen auf die ausgewiesene Dosis von 44% entsprechend ca. 440 µg Feinpartikel-dosis bei marginalem Rückstand in Vial, Inhalator und Rachen von nur 2,6%. Durch Anwendung der Lyophilisation als Herstellungsverfahren konnte ein labiler Wirkstoff in eine Formulierung gebracht werden, die pulmonal appliziert werden kann. Die mithilfe des atemzuggesteuerten Inhalators dispergierten Lyophilisate führten zu Trockenpulveraerosolen, die hinsichtlich des lungengängigen Anteils der Exubera®-Formulierung, die eine Fein-partikelfraktion von 41% erreichte, leicht überlegen sind. Der im Rahmen dieser Untersuchungen entwickelte atemzuggesteuerte Inhalator ist aufgrund seiner geringen Größe aber weitaus patientenfreundlicher. Das entwickelte System aus einem Lyophilisat geringer Dichte in Kombination mit dem einfach zu benutzenden Inhalator stellt durch seine Versatilität auch für viele andere inhalativ zu applizierende Wirkstoffe eine gute Alter-native zu den auf dem Markt erhältlichen Inhalationssystemen dar.

The present study describes the development of low-density freeze-dried protein compositions intended for inhalation with human insulin as model protein and inhalation systems for application thereof. At first, various substances were evaluated regarding their ability to act as protein stabilizers. After accomplishing and analyzing the results of physicochemical measurements, one formulation seemed to be appropriate in particular, containing 1 mg of human insulin besides glutamic acid and polysorbate 80. This combination shows a favourable and applicable glass transition temperature of the maximally freeze-concentrated solution of about -28°C and leads to mechanically stable semi-crystalline lyophilisates after freeze-drying. The protein is protected against pertubations during lyophilisation and storage by an amorphous matrix while semi-crystalline glutamic acid forms a framework warranting mechanical stability. The concentration of excipients was found to be essential in terms of maintaining biological activity of insulin and enabling dispersion into a fine aerosol. High concentrations led to fully active insulin after lyophilization but poor aerosolization performance. Low concentrations led to loss of activity but promising aerosolization properties indicating a lack between activity preservation and dispersibility. With a content of 1 mg per single dose, insulin is high dosed compared to other inhaled therapeutics, for example tiotropium bromide with a single dose of only 18 µg. By application of such a low-dosed API the conflict between dispersibility and stability will possibly be eliminated. Due to the extremely low density of the freeze-dried composition of 0.006 g/cm³ it was easily dispersed into a fine aerosol by an impact of air suitable for lung delivery. This mechanism was used by both of the developed inhalation systems. The first one was based on an active dispersion mechanism by an impact of a gas, regardless whether nitrogen or pressurized air was used. By this impact, the lyophilisate was dispersed in to a spacer device from which the patient can inhale the aerosol taking one or several breaths. Investigations to optimize the dispersion event by changing dispersion parameters like dispersion pressure and time were unsuccessful. Resulting fine particle doses were approximately 200 µg insulin per dose which is equal to 20% fine particle fraction related to the labeled dose of 1 mg. High amounts of insulin did not reach the impactor due to high retention in spacer, vial and induction port. The optimized inhaler was designed to be breath-actuated meaning the patient himself disperses the composition by inhaling deeply through the device. It was much smaller than the previous one and had several additional advantages. No pressurized gas was needed and the quality of generated aerosols was higher. A first prototype achieved fine particle fractions as high as the active inhaler but, in contrast, with better reproducibility and higher values for delivered dose. Retention in vial, inhaler and induction port nearly could be avoided amounting to approximately 2.6% using the latest version. Fine particle doses could be increased with every conducted design of experiment with highest values gained of about 440 µg which is equal to 44% fine particle fraction related to the labeled dose of 1 mg. By using lyophilisation as production method, a labile drug as insulin could be transferred into an inhalable formulation with promising aerosol performance. The customized patient-friendly breath-actuated inhalation system in combination with the low-density freeze-dried cake yielded fine particle fractions which slightly exceeded the per-formance of the first inhalable protein formulation on the market, Exubera® from Pfizer (44% vs. 41%), wherein the developed system was smaller and much easier to handle. Its versatility could make it capable of dispersing any possible drug into an aerosol.

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Pfeffer, Jan: Entwicklung inhalierbarer lyophilisierter Proteinformulierungen und geeigneter Inhalationssysteme. 2011.

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