Mechanistic studies on the physiology of CO2 tolerance in cephalopods

Hu, Marian Yong-An

Elevated environmental CO2 concentrations (hypercapnia) are a stressor that has lately received considerable attention: anthropogenic CO2 emissions are predicted to lead to a rise in surface ocean pCO2 from 0.04 kPa up to 0.08 - 0.14 kPa within this century. The increased hydration of CO2 changes seawater chemistry, causing a drop in ocean pH. This phenomenon has been termed “ocean acidification” (OA). Changes in aquatic CO2 partial pressure affect the physiology of all water breathing animals as the CO2 concentration in body fluids will increase as well in order to maintain a substantial outward directed diffusion gradient for CO2. Among the aquatic taxa some have been identified as rather sensitive species (e.g. less active calcifying species such as corals or echinoderms) whereas others (many active species such as adult fish and cephalopods) can tolerate high CO2 concentrations over long exposure times. It was shown that more tolerant organisms share the ability to compensate for a hypercapnia induced acidosis by actively accumulating bicarbonate and eliminating protons from their body fluids. This process requires the presence of an acid-base regulating machinery consisting of a variety of ion transporters and channels. Using in situ hybridization and immuno histochemical methods, the present work demonstrates that Na+/K+-ATPase (NKA), a V-type-H+-ATPase (V-HA), and Na+/HCO3- cotransporter (NBC) are co-localized in NKA-rich cells in the gills of cephalopods. Furthermore, mRNA expression patterns of these transporters and selected metabolic genes were examined in response to moderately elevated seawater pCO2 (0.16 and 0.35 kPa) over a time-course of six weeks in different ontogenetic stages. Our findings support the hypothesis that the energy budget of adult cephalopods is not significantly compromised during long-term exposure to moderate environmental hypercapnia. However, the down regulation of ion-regulatory and metabolic genes in late stage embryos, taken together with a significant reduction in somatic growth, indicates that in contrast to adult cephalopods early life stages are challenged more severely by elevated seawater pCO2. This increased sensitivity of cephalopod early life stages could be due to two primary reasons. The first is related to gill development: similar to the situation in fish and decapod crustaceans, the cephalopod gill is the most important site for ion-regulatory processes. During larval development, rudimentary gill structures occur at stage 20, and differentiate over the course of embryonic development as well as after hatching. This differentiation indicates that gas exchange and ion regulatory capacity might be fully activated only after leaving the protective egg capsule. This could partially explain the higher susceptibility of embryonic stages to environmental hypercapnia. The second reason for a higher sensitivity is due to the oviparous type of development in cephalopods. Cephalopod embryos are exposed to very low egg fluid pO2 values (<6 kPa, ca. 28% air saturation) and high pCO2 values (>0.3 kPa) under control conditions during the final phase of embryonic development. This is due to increasing metabolic rates and the egg casing acting as a diffusion barrier for dissolved gases. The present work demonstrates that environmental pCO2 is additive to the natural accumulation of CO2 in the perivitelline fluid (PVF). This almost linear increase of PVF pCO2 is necessary in order to conserve the CO2 diffusion gradient across the egg capsule that drives excretion of metabolic CO2 to the seawater. Thus, alterations in environmental pCO2 create a greater challenge to the developing embryo in comparison to juveniles or adults. Despite the lack of adult-like high capacity ion regulatory epithelia (e.g. gills or kidneys) the present work demonstrates for the first time that cephalopod embryonic stages exhibit convergent acid-base regulatory features compared to teleosts. Epidermal ionocytes scattered on skin and yolk sac appear to be responsible for ionic and acid-base regulation before gill epithelia become functionable. Acid-base regulatory capacities are important for fish and cephalopod embryos, due to the beforehand mentioned, challenging abiotic conditions inside the protecting egg capsule. These epidermal ionocytes were characterized via immunohistochemistry, in situ hybridization and vital dye staining techniques. Similar to findings obtained in teleosts NHE3-rich cells take up sodium in exchange for protons, illustrating the energetic advantage of NHE based proton excretion in marine organisms. Using in vivo electrophysiological techniques, it was proven that acid equivalents are secreted by the yolk and skin integument. The findings of the present work add significant knowledge to our mechanistic understanding of hypercapnia tolerance in marine organisms, as it demonstrates that cephalopods which were identified as powerful acid-base regulators in the context of ocean acidification already need to exhibit strong acid-base regulatory abilities during all phases of their life cycle. The convergence of key acid-base regulatory proteins in cephalopods and fish suggest that in a variety of marine ectothermic animals extracellular pH regulation mechanisms may follow common evolutionary principles.

Aufgrung der stetig steigenden CO2 Konzentrationen in der Atmosphäre hat Hyperkapnie als abiotischer Stressor in aquatischen Systemen in den letzten Jahren mehr und mehr an Aufmerksamkeit gewonnen. Modellberechnungen zufolge könnte, verursacht durch durch die anthropogenen CO2 Emmissionen, noch innerhalb dieses Jahrhunderts der pCO2 im Oberflächenwasser der Ozeane von derzeit 0.04 auf etwa 0.08 - 0.14 kPa ansteigen. Dies beeinflusst die Karbonatchemie des Meerwassers und hat zur Folge, dass der pH im Oberflächenwasser der Ozeane sinken wird. Dieses Phänomen wurde als Ozeanversauerung bezeichnet. Der Anstieg im CO2 Partialdruck beinflusst alle aquatischen Organismen, da der Anstieg des pCO2 im Wasser ebenfalls zu einer Erhöhung des Blut pCO2 führt. Die Aufrechterhaltung eines ausreichenden pCO2 Gradienten ist essentiell, um die diffundive Exkretion von CO2 vom Körper an das Wasser zu gewährleisten. Unter den marinen Organismen wurden einige taxonomischen Gruppen als besonders sensibel eingestuft (in der Regel weniger aktive, kalzifizierende Spezies wie z.B. Korallen und Echinodermaten), wohingegen aktive Taxa wie adulte Cephalopoden und Fische relativ tolerant erscheinen. Frühere Studien haben gezeigt, dass adulte Cephalopoden und Fische hohe CO2 Konzentrationen über lange Zeiträume tolerieren können, ohne ihr Wachstum oder Kalzifizierungsraten zu verringern. Es hat sich gezeigt, dass diese Toleranz mit der Fähigkeit zusammen hängt, eine Hyperkapnie-induzierte Azidose durch die aktive Akkumulation von Bikarbonat im und / oder durch die Sekretion von Protonen aus dem Blut zu kompensieren. Diese Fähigkeit ist abhängig von einem ionenregulatorischen Apparat, der aus einer Vielzahl von Säure-Base relevanten Transportproteinen besteht. Mit Hilfe von in situ Hybridisierung und immunohistologischen Methoden konnte diese Arbeit zeigen, dass wichtige Transportproteine wie z.B. Na+/K+-ATPase (NKA), H+-ATPase (V-HA), und Na+/HCO3- Kotransporter (NBC) in spezialisierten Epithelien in der Cephalopodenkieme kolokalisiert sind. Darüber hinaus wurden Expressionsmuster dieser Transporter und weiterer ausgewählter metabolischer Gene in Bezug auf erhöhte Seewasser pCO2 (0,16 und 0,35 kPa) über eine Dauer von sechs Wochen in unterschiedlichen ontogenetischen Stadien untersucht. Ausserdem wurde das Wachstum der verschiedenen Stadien bestimmt und O2- und pCO2-Konzentration in der Eihülle wurden gemessen. Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Energiebudgets bei adulten Cephalopoden nicht signifikant durch chronisch erhöhten Seewasser pCO2 beeinflusst werden. Allerdings zeigte sich eine höhere Sensitivität bei frühen Entwicklungsstadien in Form einer verringerten Expression von ionenregulatorischen und metabolischen Genen begleitet durch eine signifikante Verzögerung in Wachstum und Entwicklung. Diese erhöhte Sensitivität bei frühen Entwicklungsstadien kann durch zwei Hauptgründe erklärt werden. Der Erste steht im Zusammenhang mit der Entwicklung ionenregulatorischer Epithelien. Ähnlich wie bei Fischen und Crustaceen ist auch bei Cephalopoden die Kieme eines der wichtigsten ionenregulatorischen Organe. Während der Larvalentwicklung entstehen rudimentäre Kiemenanlagen im 20. Entwicklungsstadium und differenzieren sich im Laufe der weiteren Ontogenese bis hin zum Schlüpfling. Diese späte Differenzierung legt nahe, dass die Fähigkeit zum Gasaustausch und die volle ionenregulatorische Kapazität erst nach dem Verlassen der schützenden Eikapsel erreicht werden. Das Fehlen ionenregulatorischer Strukturen wie man sie in adulten Tieren vorfindet, kann ein möglicher Grund für eine erhöhte Sensitivität bei frühen Entwicklungsstadien sein. Der Zweite Grund für eine höhere Empfindlichkeit bei Embyonalstadien kann durch die ovipare Entwicklung bei Cephalopoden erklärt werden. In der finalen Entwicklungsphase im Ei sind Cephalopodenembryos bereits unter Kontrollbedingungen sehr geringen O2 Konzentrationen (<6 kPa, ca. 28% Luftsättigung) und hohen pCO2 Werten (>0,3 kPa) ausgesetzt. Dies liegt an den steigenden metabolischen Raten und der Eischale, die eine Diffusionsbarriere für gelöste Gase darstellt. Diese Arbeit zeigt ferner, dass Anstiege des pCO2 im Seewasser additiv zum bereits hohen pCO2 in der Perivittellinflüssigkeit (PVF) sind. Der fast lineare Anstieg des PVF pCO2 ist notwendig, um den Diffusionsgradienten von respiratorischem CO2 aus dem Ei aufrecht zu erhalten. Aufgrund dieser Erkenntnis kann geschlossen werden, dass Anstiege des Umgebungs-pCO2 einen größeren Stressor für Embryonalstadien (im Ei) darstellen als für Juvenile oder Adulte. Trotz fehlender adult-typischer ionenregulatorischer Organe (Kiemen, Nieren und Darm) bei frühen Entwicklungsstadien zeigt diese Arbeit zum ersten Mal, dass Cephalopodenembryos konvergente Säure-Base regulatorische Strukturen zu Fischen entwickelt haben. Ionocyten auf der Haut und dem Dottersack sind für den Säure-Base-relevanten Ionentransport verantwortlich bevor die Kiemenepithelien voll differenziert und funktional sind. Säure-Base Regulation ist bereits für die frühen Entwicklungsstadien aufgrund der zuvor genannten extremen hypercapnischen Bedingungen in der Eikapsel von großer Wichtigkeit. Epidermale Ionocyten wurden anhand von in situ Hybridisierung, immunohistochemischen und „vital dye“-Färbungen charakterisiert. Ähnlich wie bei Fischen scheinen Zellen, die reich an NHE3 sind, Natrium im Austausch gegen Protonen aufzunehmen. Der Einsatz von NHE-Proteinen kann als energetisch günstigere Variante der Protonenexkretion in marinen Organismen verstanden werden. Darüber hinaus zeigen in vivo elektrophysiologische Techniken, dass die Sekretion von Säureequivalenten tatsächlich über den Dottersack und die Haut stattfindet. Diese Arbeit trägt signifikant zu unserem mechanistischen Verständnis der Hyperkapnietoleranz bei marinen Organismen bei. Sie zeigt, dass Cephalopoden, die im Kontext der Ozeanversauerung als tolerant identifiziert wurden, Mechanismen besitzen, um aktiv ihren Säure-Base Haushalt zu regulieren. Ferner besitzen Cephalopoden in allen Phasen ihrer Ontogenie signifikante Säure-Base regulatorische Kapazitäten und spezialisierte Organe, die auf eine konvergente Evolution mit Teleosteern hindeuten.

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Hu, Marian: Mechanistic studies on the physiology of CO2 tolerance in cephalopods. 2011.

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