Sind Aquaporine an der Zellwanderung beteiligt?

von Bülow, Julia

Zur Untersuchung der Fragestellung, ob Aquaporine an der Zellwanderung beteiligt sind, wurde in dieser Arbeit D. discoideum als Modellorganismus verwendet. Ausgangspunkt war die Identifizierung von drei neuen putativen Aquaporin-Genen im Genom von D. discoideum. Der Schwerpunkt der Arbeit wurde auf DdAQP2 gelegt, welches aus cDNA von D. disocideum-Amöben erfolgreich amplifiziert werden konnte. In X. laevis-Oocyten Schwelltests konnte trotz erfolgreicher cRNA-Synthese und Expression von DdAQP2 weder Wasser- noch Harnstoff- oder Glycerolleitfähigkeit festgestellt werden. Nachdem in Protein- Sequenzvergleichen strukturelle Besonderheiten von DdAQP2 aufgefallen waren, wurden acht Mutanten hergestellt und mit Hilfe von Oocyten-Schwelltests analysiert. Nur die Mutante Delta208-219 führte zu einer fünffach erhöhten Schwellrate gegenüber Kontroll- Oocyten. Es konnte damit gezeigt werden, dass DdAQP2 ein aktiver Wasserkanal sein kann. In Kooperation durchgeführte dynamische Lichtstreuungsmessungen bestätigten dies. Die Ergebnisse legen einen gating-Mechanismus nahe, an dem die Schleife D, aber nicht der N-Terminus beteiligt zu sein scheint. Des Weiteren konnte DdAQP2 in D. discoideum- Amöben auf Proteinebene mit einem im Rahmen dieser Arbeit affinitätsgereinigten Antikörpers nachgewiesen werden. Für DdAQP2 wurden drei Banden im Western Blot detektiert. Die 31 kDa zeigte, dass in D. discoideum das erste Methionin das verwendete Startcodon ist. Zur Erklärung der 38 kDa Bande konnte gezeigt werden, dass keine N-Glykosylierung vorliegt. In Kooperation innerhalb der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass DdAQP2 vermutlich O-glykosyliert vorliegt. Die 90 kDa Bande konnte im Präblock als unspezifisch identifiziert werden. Zur intrazellulären Lokalisation von DdAQP2 wurden Fusionsproteine mit C- bzw. N-terminalem GFP verwendet. Die fluoreszensmikroskopischen Aufnahmen zeigen minimale Lokalisationsunterschiede der beiden Konstrukte. Beide zeigten Fluoreszenz in intrazellulären Foki, in der Plasmamembran und in Pseudopodien-artigen Zellausstülpungen. Es wurde ein DdAQP2-knockout-Konstrukt kloniert und damit erfolgreich Dictyostelium-Amöben transformiert.

Cite

Citation style:

von Bülow, Julia: Sind Aquaporine an der Zellwanderung beteiligt?. 2011.

Rights

Use and reproduction:
No CC License (german copyright law applies)

Export