Qualitätskontrolle der RNA-Gewinnung mit quantitativer Real-Time-PCR für Vakzinierungsmethoden mittels dendritischer Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren

Porsch, Stephan

Die Methodik der Vakzinierung mittels mit Antigen beladener dendritischer Zellen wird auf vielen Gebieten angewendet. So wird zum Beispiel versucht mittels dieser Technik eine T-Zell-Immunantwort gegen Tumor-Antigene einzuleiten. Daraus soll dann eine Unterdrückung von Metastasenbildung resultieren. Diese Strategien haben sich aber noch nicht als Standardmethode durchgesetzt und befinden sich noch in der klinischen Erprobung. Ein Nachteil des Verfahrens ist, dass bisher noch keine ausreichende und hochwertige Qualitätskontrolle bei der Gewinnung der Tumor- RNA möglich war. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Überprüfung einer Möglichkeit zu dieser Kontrolle mittels der Durchführung einer quantitativen Real-Time Reverse Transkriptase-PCR. Dazu wurde zunächst eine Suche nach einem geeigneten Markergen mittels der herkömmlichen PCR mit vorgeschalteter, separater Reverse Transkriptase Reaktion durchgeführt. Es wurden das pemphigus vulgaris Antigen Desmoglein 3, der Apoptose- Hemmer Survivin und das Tumor-assoziierte epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM auf ihre Eignung als Markergen hin untersucht. Es stellte sich heraus, dass sich das Gen EpCAM am besten eignete, da es bei den RNA-Präparationen am zuverlässigsten in voller Länge vorlag. Dass es in voller Länge vorlag, wurde durch die Etablierung dreier Primerpaare für das Markergen getestet. Hierbei wurden Primerpaare für die PCR von Genanteilen aus dem Beginn der cDNA, dem Ende der cDNA und eine Sequenz in der Mitte gesucht. Nachdem die Primerpaare gefunden worden waren, wurde die qRT-PCR etabliert. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit der Echtzeit- Detektion und liefert somit eine genaue Quantifizierung der PCR- Produkte, wodurch eine präzise Qualitätskontrolle möglich wird. Um dieses Vorgehen zu validieren, wurden Versuche mit einer degradierten RNA und einer Verdünnungsreihe der RNA unternommen. Diese Methodik erwies sich als sensibles Werkzeug bei der Qualitätskontrolle der RNA, so dass gesagt werden kann, dass die qRT- PCR in diesem Bereich eingesetzt werden kann.

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Porsch, Stephan: Qualitätskontrolle der RNA-Gewinnung mit quantitativer Real-Time-PCR für Vakzinierungsmethoden mittels dendritischer Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren.

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