Evolution der Verteidigungsstrategien von Blattkäferlarven (Chrysomelidae) unter Nutzung pflanzlicher Vorstufen

Michalski, Carmen

Die Larven der Blattkäfer C. populi und C. tremulae sind in der Lage den eigentlich fraßhemmenden Sekundärstoff Salicin ihrer Futterpflanze unbeschadet aufzunehmen und diesen im Extrazellularraum des Wehrapparates enzymatisch in Salicylaldehyd umzuwandeln. Das Salicylaldehyd können die Larven wiederum effktiv gegen ihre eigenen Fraßfeinde einsetzten. Zur Erlangung dieser Fähigkeit wurden vermutlich die β-Glucosidase und die Oxidase aus der ursprünglichen autogenen Wehrsekretsynthese verwandter Blattkäferlarven rekrutiert. Um Aufschluss über die Evolution der an der Wehrsekretsynthese beteiligten Enzyme zu erhalten, wurde bereits in früheren Arbeiten eine full-length-Sequenz der SAO aus C. tremulae sowie eine Teilsequenz der SAO aus C. populi identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Vervollständigung der Teilsequenz mittels 5‘-RACE. Beide cDNA-Sequenzen wurden heterolog in E. coli-Zellen mit dem Chaperon pREP4-groELS coexprimiert. Anhand eines Enzymassays, dessen Produkt mittels GC und GC-MS quantifiziert und qualifiziert wurde, konnte eindeutig belegt werden, dass es sich bei den identifizierten cDNA-Transkripten um die gesuchten SAOs aus den Wehrapparaten handelt. Die Zugehörigkeit der Sequenzen zur Familie der GMCs konnte durch Eingabe in BLAST und anhand homologer Bereiche in Alignments mit verschiedenen GMC-Sequenzen gezeigt werden. Die Familie der GMCs gliedert sich nochmals in mehrere Unterfamilien. Ein Sequenzvergleich der SAOs mit GMC-Sequenzen aus T. castaneum zeigte, dass die SAOs der Unterfamilie der ιGMCs zugeordnet werden können. Dadurch wurde erstmalig die Funktion zweier ιGMCs-Sequenzen beschrieben. Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass der gemeinsame genetische Ursprung der SAOs und der Oxidasen aus dem autogenen Syntheseweg in der Unterfamilie der ιGMCs zu finden ist. Zur Untersuchung weiterer Oxidasen wurden u.a. die Larven von P. vitellinae herangezogen. Die Identifizierung des cDNA-Transkriptes der PvSAO erfolgte auf gleiche Weise wie die der Pappelblattkäferlarven. In einem Sequenzvergleich konnte gezeigt werden, dass die PvSAO wie die CpSAO und CtSAO zur Familie der ιGMCs gehört. Neben der Identifizierung der Oxidase unterschieder Wehrsekretsynthesen aus verschiedenen Käferlarven wurden zusätzlich Versuche zur Identifizierung der genetischen Information der β-Glucosidase und Katalase aus C. populi durchgeführt, die ebenfalls an der Wehrsekretsynthese beteiligt sind. Während für die Katalase eine Teilsequenz identifiziert werden konnte, wurden für die β-Glucosidase zwei unterschiedliche full-length-Sequenzen identifiziert. Die Durchführung gewebespezifischer RT-PCRs belegte, dass das cDNA-Transkript der CpGLUWA2 im Wehrapparat exprimiert ist. So ist mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass die CpGLUWA2 die im Wehrsekret ablaufende Reaktion von Salicin zu Salicylalkohol katalysiert.

Larvae of C. populi and C. tremulae use a specific defence strategy to displace their predators. Upon attack they release defensives chemical from specialized glands. Larvae need to take up salicin as an herbal precursor from leaves of their host plant (poplar trees) to produce the defensive secretion. To achieve the ability to transform salicin into salicylaldehyde larvae have most likely recruited the salicyl alcohol oxidase (SAO) from an oxidase involved in the autogenous biosynthesis of iridoid monoterpenes that is found in related Chrysomelid leaf beetle species. This work focuses on the identification and characterization of specific SAOs from the defensive secretions of C. populi and tremulae in order to understand the evolution of the enzymes that have been evolved during adaptation of larvae to new host-plants. A full-length cDNA encoding for CtSAO was already identified by Mohagheghi (2007) as well as part of the cDNA encoding CpSAO that was accomplished by 5’-RACE during this work. Both cDNA-sequences were cloned and heterologously coexpressed in E. coli-cells with the chaperon pREP4-groESL. Enzyme activity and quantification of the produced salicylaldehyde was measured by gas chromatography. Biochemical analyses showed that both enzymes have basically the same characteristics as the native CpSAO that was characterized in the past. Sequence comparison revealed that the SAOs belong to the family of glucose-methanol-choline oxidoreductase-like sequences (GMCs) with mostly unknown function. Comparing the SAOs with GMC-like sequences from T. castaneum, SAOs were found to be part of the ιGMCs-subfamily. This suggests that the SAOs and the oxidase from the autogenous biosynthesis share a common ancestor belonging to the ιGMCs-subfamily. For further studies of the evolutionary origin of the specific oxidase larvae of P. vitellinae were examined. The cDNA encoding for the PvSAO was identified the same way as the cDNA from C. populi and tremulae. Sequence comparison with CpSAO, CtSAO and GMC-like sequences from T. castaneum showed that that PvSAO is also a member of the ιGMC-subfamily. Beside the identification of different oxidases from various defensive strategies this work also concentrated on identifying the β-glucosidase und catalase from larvae of C. populi. Part of the catalase-like sequence was found that could be related to the synthesis of the defensive secretion. Unlike that two different sequences were found showing homology to β-glucosidase. Since both sequences feature a signal peptide tissue specific RT-PCR was performed to analyze the expression site of both sequences. This experiment revealed that the cDNA-sequence of CpGLUWA2 is expressed in the defensive glands. So it is most likely that CpGLUWA2 catalysis the hydrolysis of the plant-derived salicin.

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Michalski, Carmen: Evolution der Verteidigungsstrategien von Blattkäferlarven (Chrysomelidae) unter Nutzung pflanzlicher Vorstufen.

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