Anti-settlement defence of Fucus vesiculosus Chemistry and ecology

Saha, Mahasweta

Summary Bacteria are omnipresent in the marine environment. For example, in the Kiel Fjord (Baltic Sea) 0.7 to 2.24 x 106 bacterial cells are present in one ml of seawater. Marine organisms are thus continuously exposed to high densities of bacteria, some of which tend to settle and colonise living surfaces. Some associations between host and bacteria could be neutral or mutualistic, for example algae associated bacteria may protect their host from fouling. But mostly, bacterial epibionts have a number of negative impacts on their hosts, such as providing positive settlement cues to macrofoulers. Although macroalgae constitute a potential substratum for surface colonisation, many of them remain largely free from heavy fouling, presumably due to surface properties or release of antifouling chemicals. In the Baltic Sea this has also been observed in the ecologically important alga Fucus vesiculosus (Phaeophyceae), which remains free from heavy fouling during most of the year. So far there was no indication of a mechanical or structural defence against epibionts in this alga, which suggested that one or several chemical defence mechanisms may exist. The chemical defence of macroalgae has been a theme of literature over two decades. But so far, most of these effects have been demonstrated in studies investigating total tissue extracts instead of testing ecologically relevant surface extracts or surface metabolites at natural concentrations, which actually affect the fouling organisms in nature. Further, only very few among the studies which so far tested surface based compounds at ecologically relevant concentrations targeted the first phase of fouling, i.e. bacterial settlement. It was a main aim of my work to study the effect of surface-associated metabolites on microbial settlement, using the rockweed Fucus vesiculosus as a model organism. Since the control of bacterial fouling on macroalgae is of substantial ecological importance, it is highly relevant to characterize the nature and dynamics of potential bacterial settlement inhibitors - the first line of defensive compounds against microfoulers. In F. vesiculosus, polyphenols have been suggested as fouling deterrents. However, a bioassay-guided structure elucidation of the alga’s metabolites deployed in defence against bacterial settlement has been realized for the first time in my study, and a role of polyphenols in antimicrobial defence of F. vesiculosus was not detected. Using different chromatographic techniques followed by bioassays, I was instead able to isolate and identify an active lipophilic metabolite: fucoxanthin (Chapter I). Subsequently, I proved its surface presence. This was followed by an investigation of the metabolic provenance through segregation of fucoxanthin originating from Fucus and fucoxanthin originating from surface associated diatoms. Further I quantified the compound on algal tips and on whole individuals, in order to know whether it is sufficiently concentrated on the algal surface to warrant an inhibitory effect on bacterial settlers. With the help of this comprehensive study, I was able to report a novel defence strategy of Fucus. In chapter II, I proceeded to investigate the active polar metabolites on Fucus surfaces and reported DMSP and proline to be the hydrophilic metabolites contributing to an inhibition of bacterial settlement. This was the first study reporting the role of DMSP and of the amino acid proline as algal antifoulants. The combined results of chapter I and II provides a picture of multiple chemical defence strategies of Fucus vesiculosus in an ecological context. In chapter III, I show how the algal defence based on these inhibitors may be affected by environmental factors/ shifts such as high temperature and low light. Based on the surface concentrations of the three settlement inhibitors the defence capacity of F. vesiculosus appears to be only moderately affected by potential stressors. Finally, I report on the seasonal and geographical variation of antibacterial defence of the alga (Chapter IV). The anti-settlement defence showed a temporal variation with a peak activity in late summer/ autumn and also showed a strong and consistent difference between sites throughout the year. In summary this thesis highlights the capability of the Baltic foundation species Fucus vesiculosus for chemical defence against microfoulers, as well as the natural defence variability with site and season and the alga’s responses toward simulated environmental conditions. The study thus provides numerous new insights into algae-bacteria interactions and their dynamics and it helps in better understanding of the alga’s reaction towards bacterial epibiosis in response to potential abiotic stressors.

Zusammenfassung Bakterien sind im marinen Lebensraum weit verbreitet. In der Kieler Förde finden sich beispielsweise 0.7 bis 2.24 x 106 Bakterienzellen in einem ml Meerwasser. Meeresorganismen sind also ständig einem relativ hohen Besiedelungsdruck durch solche Bakterien ausgesetzt, die lebende Oberflächen als Substrat nutzen können. Die Beziehungen zwischen Wirt und Bakterium sind manchmal neutral oder sogar mutualistisch, beispielsweise können manche algenassoziierte Bakterien ihren Wirt vor der Besiedlung durch andere Aufwuchsorganismen schützen. Öfter haben bakterielle Besiedler aber negative Effekte, beispielsweise indem sie durch die Freisetzung von Signalstoffen weitere Aufwuchsorganismen anlocken. Obwohl die Oberflächen von Makroalgen potentiell ein Substrat für Aufwuchsorganismen darstellen, sind viele Algen weitgehend frei von Aufwuchs, möglicherweise aufgrund ihrer Oberflächeneigenschaften oder weil sie aufwuchshemmende Metabolite abgeben. In der Ostsee wurde dies an der ökologisch wichtigen Algenart Fucus vesiculosus (Phaeophyceae) beobachtet, die während des größten Teil des Jahres fast frei von Aufwuchs ist. Bisher gibt es keine Anzeichen für eine mechanische oder strukturell bedingte Abwehr dieser Alge gegen Epibionten, so daß die Existenz chemischer Verteidigung - möglicherweise auch multipler chemischer Verteidigungsstrategien – nahe lag. Die chemische Verteidigung von Makroalgen gegen Aufwuchsorganismen wird seit zwei Jahrzehnten in der wissenschaftlichen Literatur behandelt. Die meisten der vorliegenden Arbeiten beschreiben aber Effekte von Gewebeextrakten, die sich in ihrer Zusammensetzung und Konzentration meistens deutlich von Oberflächenextrakten unterscheiden und Aufwuchsorganismen unter natürlichen Bedingungen daher nur selten beeinflussen. Die wenigen mit natürlich konzentrierten Oberflächenextrakten durchgeführten Arbeiten berücksichtigten darüber hinaus meist nicht die Verteidigung gegen bakterielle Besiedlung, obwohl diese den notwendigen ersten Schritt bei der Entwicklung von Aufwuchsgemeinschaften darstellt. Ein Hauptziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb darin den Effekt von an der Oberfläche vorhandenen Abwehrmetaboliten zu untersuchen, wobei Fucus vesiculosus als Modellorganismus verwendet wurde. Die Notwendigkeit zur Beschreibung des Charakters und der Dynamik von Metaboliten, die die bakterielle Besiedelung von Fucus vesiculosus hemmen, ergibt sich aus der Tatsache dass diese Abwehrstoffe die erste Verteidigungslinie gegen Aufwuchs in einem Organismus von erheblicher ökologischer Bedeutung darstellen. In vorhergehenden Untersuchungen an F. vesiculosus wurde eine Rolle von Polyphenolen als Aufwuchs hemmende Abwehrstoffe vorgeschlagen. Eine Bioassay-geleitete Strukturaufklärung der relevanten Algenmetaboliten in der Verteidigung gegen bakteriellen Aufwuchs wurde jedoch in der vorliegenden Arbeit erstmalig durchgeführt und ergab keinen Hinweis auf eine Rolle von Polyphenolen. Durch Einsatz verschiedener chromatographischer Techniken in Kombination mit Bioassays konnte vielmehr der lipophile Metabolit Fucoxanthin isoliert und als Abwehrstoff identifiziert werden (Kapitel I). Anschliessend wurde seine Anwesenheit auf der Algenoberfläche überprüft und bestätigt. Es folgte eine getrennte Quantifizierung von direkt aus F. vesiculosus und von aus epiphytischen Diatomeen stammendem Fucoxanthin. Ausserdem wurden Fucoxanthin-Konzentrationen auf Thallusspitzen und auf ganzen Thalli bestimmt und es wurde getestet ob derartige Konzentrationen ausreichen um verschiedene potentiell auf Fucus siedelnde Bakterien zu hemmen. Durch diese umfassenden Arbeiten konnte eine neue Verteidigungsstrategie in F. vesiculosus identifiziert werden. Kapitel II beschreibt die Identikation von DMSP und Prolin als hydrophilere Metaboliten, die ebenfalls zur Hemmung bakterieller Besiedler auf Fucus-Oberflächen beitragen. Beide Metaboliten werden hier erstmalig als Algen-Abwehrstoffe gegen Aufwuchs vorgeschlagen. Die Ergebnisse der Kapitel I und II zusammen machen deutlich dass Fucus vesiculosus multiple chemische Verteidigungsstrategien gegen Aufwuchs besitzt. In Kapitel III wird gezeigt wie die Verteidigung der Alge mittels der verschiedenen Inhibitoren durch Umweltveränderungen wie Temperaturerhöhung oder Lichtverminderung beeinflusst wird. Insgesamt scheinen die Oberflächenkonzentrationen der drei Inhibitoren und damit die Verteidigungsfähigkeit von F. vesiculosus nur geringfügig durch Faktoren wie Temperatur oder Licht beeinflusst zu sein. Dennoch existiert eine jahreszeitliche und geographische Variabilität in der antibakteriellen Verteidigung der Alge (Kapitel IV). Die Abwehr gegen bakterielle Besiedelung erreichte ihren Höhepunkt im Spätsommer und Herbst und war ganzjährig deutlich unterschiedlich wenn Algen aus verschiedenen Freilandpopulationen verglichen wurden. Die vorliegende Arbeit bestätigt und erklärt also die Fähigkeit der habitatbildenden Ostseealge Fucus vesiculosus zur chemischen Verteidigung gegen bakterielle Aufwuchsorganismen. Die Arbeit beschreibt darüber hinaus die Variabilität dieser Verteidigung zwischen Populationen, Jahreszeiten und verschiedenen experimentellen Bedingungen. Die Dynamik von Algen-Bakterien-Wechselwirkungen wird von einer neuen Warte aus dargestellt, die es insbesondere erlaubt die Abwehr gegen Aufwuchs unter variierenden nichtbiotischen Stressbedingungen besser einzuschätzen.

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Saha, Mahasweta: Anti-settlement defence of Fucus vesiculosus Chemistry and ecology.

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