Characterization of the LysR-type Transcriptional Regulator HsdR Gene and Its Adjacent Short-chain Dehydrogenase/Reductase SDRx Gene in Comamonas testosteroni ATCC 11996

Gong, Wenjie

3a-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase (3a-HSD/CR) from Comamonas testosteroni (C. testosteroni) is a key enzyme in the degradation of steroid compounds in soil and water. Interestingly, 3a-HSD/CR gene (hsdA) expression can be induced by steroids like testosterone and progesterone. Thus, the regulatory mechanism of 3a-HSD/CR induction has attracted considerable attention of our group. Previously, it has been shown that induction of hsdA expression by steroids is a derepression where steroid inducers bind to two repressors, RepA and RepB, thereby preventing blocking of hsdA transcription and translation, respectively. In the present study, a new LysR-type transcriptional factor HsdR for 3a-HSD/CR expression in C. testosteroni was identified. The hsdR gene locates 2.58 kb downstream of the hsdA gene on the C. testosteroni ATCC 11996 chromosome with an orientation opposite to hsdA. The hsdR gene was cloned and the recombinant HsdR protein was overproduced, and an anti-HsdR polyclonal antibody was subsequently prepared. While heterologous transformation systems revealed that HsdR activates the expression of the hsdA gene, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed that HsdR specifically binds to the hsdA promoter region. Furthermore, the activity of HsdR is dependent on the decreased repression by RepA. in vitro binding assays clearly indicated that HsdR can contact with RNA polymerase. Interestingly, an hsdR disrupted mutant expressed low levels of 3a-HSD/CR compared to wild type C. testosteroni after testosterone induction. In addition, HsdR itself cannot be induced by testosterone. As a member of LysR-type regulators, HsdR may also repress it own expression. Here, electrophoretic mobility shift assays indicated that HsdR specifically binds to its own promoter. As expected, mutated HsdR expression in an hsdR-gfp fusion mutant and an hsdR gene disrupted mutant of C. testosteroni increased compared to that in the wild type strain, largely because autorepression of HsdR in these mutants is prevented. This result revealed that HsdR negatively regulates its own expression. Phylogenetic analyses indicated that HsdR is related to the contact-regulated gene A (CrgA) from Neisseria meningitidis, which exists as an octamer. To detect the active form of HsdR, three truncated proteins, HsdRΔN (residues 1-86 deleted), HsdRΔC (residues 221-303 deleted), and HsdRΔNC (residues 1-86 and 221-303 deleted), were constructed and purified. These deleted domains are important for the positive control of HsdR on 3a-HSD/CR expression. Western blotting indicated that HsdR may also exist as an octamer, where the central domain is crucial for the multimerization of HsdR. Unexpectedly, gel filtration chromatography showed that there are two dominant oligomers (octamer and hexamer) present for HsdR and its truncated proteins. Taken together, HsdR is a positive transcription factor for 3a-HSD/CR expression in C. testosteroni, and it may also negatively regulate its own expression. In addition, a novel gene SDRx, which is divergently transcribed from the hsdR gene, was found to be a member of the short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) superfamily. The open reading frame of this SDRx consists of 768 bp and translates into a protein of 255 amino acids. Two consensus sequences of the SDR superfamily were found, an N-terminal Gly-X-X-X-Gly-X-Gly cofactor-binding motif and a Tyr-X-X-X-Lys segment (residues 160-164 in the SDRx sequence) essential for catalytic activity of SDR proteins. Phylogenetic analyses indicated that the novel SDRx gene from C. testosteroni, which is active in steroid metabolism, is related to 7α-hydroxysteroid dehydrogenase (7α-HSD). Degradation of the steroids testosterone and estradiol decreased in the SDRx knock-out mutant strain. Furthermore, growth on the steroids cholic acid, estradiol and testosterone was impaired in the SDRx knock-out strain. Combined, the novel SDRx in C. testosteroni was identified as 7α-HSD that is involved in steroid degradation.

Die 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase/Carbonyl-Reduktase (3α-HSD/CR) von C. testosteroni ist ein Schlüsselenzym im Abbau von Steroid-Verbindungen in Boden und Wasser. Bemerkenswerterweise kann die Expression des 3α-HSD/CR Gens (hsdA) durch Steroide wie Testosteron und Progesteron induziert werden. Die Aufklärung dieses Regulationsmechanismus der 3α-HSD/CR Induktion ist Gegenstand intensiver Forschung. Bisher hat sich gezeigt, dass die Induktion der hsdA Expression durch Steroide eigentlich eine Derepression darstellt, bei der Steroid-Induktoren an zwei Repressoren (RepA und RepB) binden, diese inaktivieren und so die Expression einleiten. In der vorliegenden Studie wurde ein neuer LysR-artiger Transkriptionsfaktor (hsdR) der 3α-HSD/CR Expression in C. testosteroni identifiziert. Das hsdR-Gen ist 2,58 kb stromabwärts des hsdA-Gens im Genom von C. testosteroni ATCC 11996 in entgegengesetzter Leserichtung lokalisiert. Das hsdR-Gen wurde in E. coli-Zellen kloniert, überexprimiert und gereinigt. Mit dem rekombinanten Protein wurde ein polyklonaler Antikörper gewonnen. Während mit heterologen Transformations-Systemen gezeigt wurde, dass hsdR die Expression des hsdA-Gens induziert, konnte durch „band-shift“-Versuche nachgewiesen werden, dass hsdR spezifisch an die hsdA Promotor-Region bindet. Dabei ist die HsdR-Aktivität eng mit der hsdA-Repression durch RepA verbunden, insofern als HsdR erst nach der Freigabe des Promotors durch RepA aktiv wird. Weiterhin zeigten in-vitro Bindungsstudien, dass hsdR an RNA-Polymerase bindet. Wie erwartet, ließen sich in hsdR knock-out Mutanten nach Testosteron-Induktion nur erniedrigte 3α-HSD/CR Level im Vergleich zum Wildtyp finden. Die hsdR-Expression wiederum ist nicht durch Testosteron induzierbar. Von LysR-Typ Regulatoren ist bekannt, dass sie im Sinne einer feed-back Regulation ihre eigene Expression unterdrücken können. Es konnte durch weitere „band-shift“-Versuche gezeigt werden, dass HsdR an seinen eigenen Promotor bindet. Wie erwartet war die Expression eines hsdR-gfp Fusionsproteins und einer hsdR-Disruptionsmutante erhöht im Vergleich zum Wildtyp, da in diesen Mutanten die Autorepression nicht stattfinden konnte. Folglich wird hsdR ebenfalls durch einen feed-back Mechanismus reguliert. hsdR ähnelt dem Kontakt-regulierten Gen A (CrgA) von Neisseria meningitidis, einem Octamer, wie sich durch phylogenetische Untersuchungen nachweisen ließ. Für weitere Analysen wurden drei Deletionsmutanten von hsdR hergestellt, denen folgende Aminosäuren fehlten: HsdRΔN (1-86); HsdRΔC (221-303); HsdRΔNC (1-86 und 221-303). Diese deletierten Domänen sind wichtig für die positive HsdR-regulierte 3α-HSD/CR Expression. Western-Blot-Ergebnisse mit diesen Mutanten zeigten, dass HsdR ebenfalls als Octamer vorliegen könnte und die zentrale Domäne entscheidend für die Multimerisierung ist. Ergebnisse aus Gelfiltrations Versuchen mit dem Wildtyp-Protein sowie den Deletionsmutanten deuten das Vorliegen von zwei Oligomeren (Octamer und Hexamer) an. Zusammenfassend ist hsdR als positiver Transkriptionsfaktor der 3α-HSD/CR Expression in C. testosteroni identifiziert worden, der die eigene Expression negativ reguliert. Darüber hinaus wurde ein neues SDR-Gen (SDRx) gefunden, das abweichend von hsdR transkribiert wird. Der open-reading-frame von SDRx umfasst 768 bp, die für ein Protein aus 255 Aminosäuren kodieren. Zwei Konsensus-Sequenzen der SDR-Superfamilie wurden gefunden, das N-terminale Gly-XXX-Gly-X-Gly-Cofaktor-Bindungsmotiv und ein Tyr-XXX-Lys-Segment (Aminosäuren 160-164 in der SDRx Sequenz), das essentiell für die katalytische Aktivität der SDR-Proteine ist. Phylogenetische Analysen lassen vermuten, dass das neu gefundene SDRx-Gen in C. testosteroni homolog zu einer 7α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (7α-HSD) ist, die am Steroidstoffwechsel beteiligt ist. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass der Abbau der Steroide Testosteron und Östradiol in SDRx knock-out Mutanten verringert ist. Außerdem war das Wachstum des SDRx knock-out-Stamms mit den Steroiden Cholsäure, Estradiol oder Testosteron als Kohlenstoffquelle geringer als das des Wildtyps.

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Gong, Wenjie: Characterization of the LysR-type Transcriptional Regulator HsdR Gene and Its Adjacent Short-chain Dehydrogenase/Reductase SDRx Gene in Comamonas testosteroni ATCC 11996.

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