Zellbiologische Effekte aktivierter Gerinnungsfaktoren auf Tumorzellen

Denker, Momme

Ein prokoagulatorischer Status ist ein typisches Symptom von Tumorerkrankungen und deren Progression und geht mit der Entwicklung tiefer Venenthrombosen sowie maligner Ergüsse einher, in denen Gerinnungsfaktoren nachgewiesen werden können. Die raumfordernden Ergüsse führen je nach Lokalisation und Umfang des Ergusses zu Brust- oder Abdominalschmerzen, Atemnot, Husten, Erbrechen, Verdauungsstörungen, Anorexie und Kachexie, Nausea sowie einer eingeschränkten Beweglichkeit, und senken die Lebensqualität der Betroffenen erheblich. Die Therapieoptionen sind spärlich, oft bleibt nur eine wiederholte Punktion der rasch rezidivierenden Ergüsse. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von PAR-Agonisten (Thrombin, SFLLRN, Faktor Xa, SLIGKV) auf die Proliferation, das Ansprechen auf Zytostatika, die Epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) und daraus folgende Änderungen im Migrationsverhalten von Tumorzellen untersucht. Ziel war es, das Verständnis der Rolle von Gerinnungsfaktoren im Ergussmilieu und im Rahmen des Metastasierungsprozesses weiter aufzuklären, um möglichen Therapieansätzen mit Gerinnungsinhibitoren den Boden zu bereiten. 107 Ergüsse aus klinisch notwendigen Punktionen wurden gesammelt, die enthaltenen Zellen isoliert und kultiviert sowie die Ergüsse nach Geschlecht und Diagnose zum Zeitpunkt des Ergusses in maligne und benigne Ergüsse charakterisiert. In einer koagulometrischen Untersuchung an 72 Ergüssen konnten alle Gerinnungsfaktoren der extrinsischen Kaskade (Faktor II, V, VII, X, Fibrinogen, Protein C, Antithrombin III) im Erguss nachgewiesen werden. Die klinischen Marker für ein aktiviertes Gerinnungssystem, D-Dimere und F1+2 Fragmente, waren deutlich erhöht. In einem chromogenen Aktivitätsassay konnten nur geringe Aktivitäten Faktor IIa und Faktor Xa im Erguss nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigten ein deutlich aktiviertes Gerinnungssystem in benignen und malignen Ergüssen, was die Frage nach deren Einfluss auf die im Erguss enthaltenen Tumorzellen aufwirft. Die aus Ergüssen isolierten Tumorzellen exprimierten membranständige PAR-1 und PAR-2 Rezeptoren, über die Thrombin und Faktor Xa zellbiologische Effekte vermitteln können. Auf der als Modellzellen eingesetzten humanen Pankreaskarzinom-Zelllinie PANC-1, der humanen monozytären Tumorzelllinie THP-1 und der nicht-tumorigenen humanen pankreatischen Epithelzelllinie HPDE konnten PAR-1 und PAR-2 Rezeptoren in unterschiedlicher Dichte nachgewiesen werden. HPDE und PANC-1 Zellen zeigten darüber hinaus eine starke intrazelluläre, granuläre Expression beider Rezeptoren. Eine Supplementierung des Kulturmediums von THP-1 Zellen mit 10 % (v/v) Erguss führte bei 60 getesteten Ergüssen im Mittel zu einer Hemmung des Zellwachstums in unbehandelten und mit Carboplatin oder Doxorubicin behandelten Zellen. Ergüsse weiblicher Patientinnen mit benigner Diagnose oder gastrointestinaler Krebserkrankung führten teilweise zu deutlich erhöhten Zellzahlen in unbehandelten und mit Zytostatikum behandelten Ansätzen, was einer Resistenz entspricht. Höhere FII Aktivitäten im Erguss korrelierten mit einer Hemmung des Zellwachstums in unbehandelten und mit Carboplatin behandelten Zellen. Stimulation der THP-1 Zellen mit PAR-Agonisten führte zu einer Hemmung des Zellwachstums sowie einer Chemoresistenz gegen Carboplatin und Doxorubicin. Die Stimulation mit PAR-Agonisten zeigte keinen konzentrationsabhängigen Einfluss auf das Zellwachstum von PANC-1 Zellen sowie das Ansprechen der Zellen auf Zytostatika. Eine Supplementierung des Kulturmediums von PANC-1 Zellen mit 10 % (v/v) Erguss führte bei den 10 getesteten Ergüssen im Mittel ebenfalls zu einer Hemmung des Zellwachstums. Die Hemmung von im Erguss enthaltenen Thrombin und Faktor Xa blieb ohne Einfluss auf das Zellwachstum was eine Rolle der Gerinnungsinhibitoren am proliferationsinhibierenden Effekt ausschließt. Abschließend wurde der Einfluss von PAR-Agonisten auf die EMT untersucht. PAR-Agonisten zeigten in HPDE und PANC-1 Zellen keinen transkriptionellen Einfluss auf die Expression der EMT-assoziierten Proteine E-Cadherin, Vimentin, N-Cadherin, L1CAM, Slug und Snail, aber induzierten eine Delokalisierung von membranständigem E-Cadherin ins Zytosol, eine Auflösung von Zellkontakten sowie eine spindelförmige Morphologie. Diese zellbiologischen Veränderungen führten zu einer erhöhten Migrationsfähigkeit sowohl der nicht-tumorigenen HPDE Zellen als auch der in der EMT weit fortgeschrittenen Karzinomzelllinie PANC-1. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen eine tumorfördernde Wirkung von Gerinnungsfaktoren auf tumorigene und nicht-tumorigene Zellen und leisten somit einen Beitrag zum Verständnis der Rolle der Gerinnungsfaktoren im Ergussmilieu und im Rahmen von Metastasierungsprozessen. Dies zeigt die Notwendigkeit einer antikoagulatorischen Therapie in Tumorpatienten oder zur Tumorprophylaxe.

A procoagulant state accompanied by deep vein thrombosis and development of expansive effusions containing coagulation factors are well known matters in cancer patients during the progression of the disease. Patients suffer from chest and abdominal pain, dyspnoea, cough, digestive disorders, vomiting, anorexia and cachexia, nausea, limited mobility resulting in a reduced quality of life. Until now therapeutical options are poor besides repetitive puncture and pleurodesis. In order to elucidate the role of coagulation factors on growth, chemosensitivity, epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cell migration of cancer cells within effusions, 108 effusions from clinically necessary punctures were collected and characterized in terms of gender and diagnosis at the date of puncture (malignant vs. benign; gynaecological, lung and gastroenterological cancers). After separating the cells from the effusions all coagulation factors of the extrinsic cascade (factor II, V, VII, X, fibrinogen) were detected at low concentrations whereas clinical markers for an activated coagulation system such as D-dimer fragments and prothrombin fragment 1.2 were significantly elevated. Thrombin and factor Xa showed almost no activity in a chromogenic assay. These findings indicate a highly activated coagulation system within the effusions without significant differences between gender and diagnosis. Tumour cells isolated from the effusions expressed PAR-1 and PAR-2 receptors that were membrane-bound but mainly localized in the cytosol. PAR-1 and PAR-2 are relevant for protease signalling and influence on the cell biology. Owing to the low proliferative activity and contamination with fibroblasts these cells were not suitable for further experiments. The alternatively used cell lines HPDE (non-tumorigenic human pancreatic duct epithelial cells), PANC-1 (human pancreatic cancer) and THP-1 (human acute monocytic leukaemia) showed variable PAR-1 and PAR-2 surface expression, and HPDE and PANC-1 cells showed a marked cytosolic expression of both receptors, too. Culture medium supplemented with 10 % (v/v) effusion fluid inhibited THP-1 cell growth and improved response to Carboplatin and doxorubicin treatment. Moreover, benign effusions and effusions from gastroenterological cancers of female patients lead to a concomitant slightly developed chemoresistance against carboplatin and doxorubicin and increased cell growth. Elevated thrombin levels within the effusions correlated with improved response to carboplatin and increased cell growth. Stimulation of THP-1 cells with PAR-agonists resulted in a PAR-1 mediated marginal inhibition of cell proliferation and a distinct chemoresistance against carboplatin and doxorubicin while PAR-2 agonist led to a chemoresistance against doxorubicin. PANC-1 cells showed no concentration-dependent response to PAR-1 and PAR-2 agonists with respect to cell proliferation and response to cytostatic drugs. However, culture of PANC-1 cells in medium supplemented with 10 % (v/v) effusion fluid inhibited cell growth. Co-incubation with Lepirudin (thrombin inhibitor) or Rivaroxaban (factor Xa inhibitor) had no influence on cell growth indicating that other factors in the effusions beside coagulation factors are responsible for the growth inhibitory effect. Finally, PAR agonists showed no transcriptional influence on EMT-associated marker proteins E-cadherin, Vimentin, N-cadherin, L1CAM, Slug and Snail in HPDE and PANC-1 cells but induced delocalisation of membrane-bound E-cadherin into the cytosol. Along with this delocalisation a dissolving of cell-cell junctions and a spindle-shaped cell morphology was observed in both cell lines. These cell biological changes could be associated with an increased cell migration in both non-tumorigenic HPDE cells and tumorigenic PANC-1 cells. In summary, these results revealed a distinct tumour progressive potential of coagulation factors on tumorigenic and even non-tumorigenic cells and contribute to the understanding of their role during tumorigenesis and metastasis. They suggest also the need of anticoagulant treatment of tumour patients and in tumour prophylactic treatment.

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Denker, Momme: Zellbiologische Effekte aktivierter Gerinnungsfaktoren auf Tumorzellen. 2011.

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